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土霉素(oxytetracyline)是一种广泛应用于畜牧业和水产养殖业中的四环素类抗生素,其无法被动物完全吸收。因动物粪便施入土壤而残留下来的土霉素导致环境中的抗生素污染问题日趋严重。抗生素通过食物链进入人体,给人类健康带来极大的危害;铜锌离子作为饲料中另外一种重要的添加剂,和抗生素形成了复合污染。对于环境中这类复合污染问题,生物修复技术具有巨大的潜能,逐渐成为人们关注的重点。目前对于微生物降解土霉素污染问题的报道还较少。本研究首先调研了芜湖市市售有机肥、农用土壤、水体及黄淮海部分地区土壤中土霉素污染情况,针对铜锌离子和土霉素的复合污染,筛选出耐铜锌离子的土霉素降解菌,研究其降解特性;探讨土霉素及土霉素降解菌对土壤微生物和植物的毒害作用,并初步探讨土霉素降解菌的耐药机制。结果如下:
1.4种市售有机肥中土霉素检出率为100%,含量范围在0.45~4.21mg/kg之间。目前我国对有机肥中抗生素的残留量没有明确的标准,但相对于其他报道,本研究中有机肥的土霉素残留量较高;市区的局部地区农用土壤中土霉素残留量较高,具有一定的生态风险,而黄淮海部分地区是畜牧养殖业大区,其部分土壤中残留的土霉素含量较芜湖市区高。市区水体中仅养殖废水中检测到土霉素,相较而言,水体中土霉素污染问题较小。
2.从养殖废水中共筛选出8株耐土霉素菌株,经分子鉴定分析分别为Cutaneotrichosporoncutaneu、台湾红酵母Rhodotorulataiwanensis、Ignatzschineriasp.无色杆菌属Achromobactersp.、节杆菌Arthrobactersp.、猪粪细菌Swinemanurebacterium、proteussp.、产碱杆菌Alcaligenessp.。经高效液相色谱(HPLC)复筛后,Cutaneotrichosporoncutaneu具有较高的土霉素降解率,编号为DJ1。DJ1菌株在接种量为1%的条件下,温度30℃,pH7.0、装液量20%,底物浓度200mg/L,培养5d后对土霉素的降解率为78.83%。在含低浓度土霉素(50 mg/L)的培养基中,添加铜离子(50 mg/L)促进了土霉素的降解率,在含高浓度土霉素(200 mg/L)中添加50mg/LCu2+和Zn2+对土霉素降解率的影响相对不大。且菌株DJ1对四环素类抗生素和铜锌离子有较高的耐性,耐受浓度均超过700mg/L,能在抗生素与重金属铜锌离子二元交叉培养基平板上生长,具有重金属铜锌与抗生素的交叉耐性。
3.当土霉素进入土壤后,细菌、真菌、放线菌的数量整体上会随着土霉素浓度的增加和时间的延长呈现降低的趋势,且三类微生物对土霉素的敏感度不同;土霉素会降低土壤中微生物的丰富度和多样性、改变群落结构。在同时添加DJ1菌液的土壤中,其丰富度和多样性会有所提升,但土壤中的抗性基因受到的影响较小。DJ1发酵液能促进萝卜和上海青的生长,同时能缓解被土霉素抑制的生长的作用。
4.在DJ1菌株中检测出4种四环素类抗生素抗性基因tetA、tetC、tetM、tetQ,序列长度分别为212bp、209bp、173bp、169bp,其中tetA、tetC属于外排泵基因,tetM、tetQ属于核糖体保护基因,这初步揭示了DJ1菌的耐药机制。并推测土霉素的降解途径涉及脱水、脱羰基、芳香环上基团的脱除和氧化反应。
1.4种市售有机肥中土霉素检出率为100%,含量范围在0.45~4.21mg/kg之间。目前我国对有机肥中抗生素的残留量没有明确的标准,但相对于其他报道,本研究中有机肥的土霉素残留量较高;市区的局部地区农用土壤中土霉素残留量较高,具有一定的生态风险,而黄淮海部分地区是畜牧养殖业大区,其部分土壤中残留的土霉素含量较芜湖市区高。市区水体中仅养殖废水中检测到土霉素,相较而言,水体中土霉素污染问题较小。
2.从养殖废水中共筛选出8株耐土霉素菌株,经分子鉴定分析分别为Cutaneotrichosporoncutaneu、台湾红酵母Rhodotorulataiwanensis、Ignatzschineriasp.无色杆菌属Achromobactersp.、节杆菌Arthrobactersp.、猪粪细菌Swinemanurebacterium、proteussp.、产碱杆菌Alcaligenessp.。经高效液相色谱(HPLC)复筛后,Cutaneotrichosporoncutaneu具有较高的土霉素降解率,编号为DJ1。DJ1菌株在接种量为1%的条件下,温度30℃,pH7.0、装液量20%,底物浓度200mg/L,培养5d后对土霉素的降解率为78.83%。在含低浓度土霉素(50 mg/L)的培养基中,添加铜离子(50 mg/L)促进了土霉素的降解率,在含高浓度土霉素(200 mg/L)中添加50mg/LCu2+和Zn2+对土霉素降解率的影响相对不大。且菌株DJ1对四环素类抗生素和铜锌离子有较高的耐性,耐受浓度均超过700mg/L,能在抗生素与重金属铜锌离子二元交叉培养基平板上生长,具有重金属铜锌与抗生素的交叉耐性。
3.当土霉素进入土壤后,细菌、真菌、放线菌的数量整体上会随着土霉素浓度的增加和时间的延长呈现降低的趋势,且三类微生物对土霉素的敏感度不同;土霉素会降低土壤中微生物的丰富度和多样性、改变群落结构。在同时添加DJ1菌液的土壤中,其丰富度和多样性会有所提升,但土壤中的抗性基因受到的影响较小。DJ1发酵液能促进萝卜和上海青的生长,同时能缓解被土霉素抑制的生长的作用。
4.在DJ1菌株中检测出4种四环素类抗生素抗性基因tetA、tetC、tetM、tetQ,序列长度分别为212bp、209bp、173bp、169bp,其中tetA、tetC属于外排泵基因,tetM、tetQ属于核糖体保护基因,这初步揭示了DJ1菌的耐药机制。并推测土霉素的降解途径涉及脱水、脱羰基、芳香环上基团的脱除和氧化反应。