我国东北黑土区土壤肥沃,然而由于近几十年持续性高强度利用,黑土已经出现肥力下降等相关的问题。保护性耕作是个很好的解决方案,免耕已被证明可以改善土壤微生物群落,然而由于研究技术的限制,免耕对土壤微生物群落的影响机制还不清楚。因此,本研究基于15年的长期定位试验,利用高通量测序和结构方程模型研究了免耕和传统耕作0-5 cm和5-20 cm深度的土壤微生物群落差异,探索耕作、土壤、微生物群落三者之间的互作关系,为在东北构建高效、生态、可持续的保护性耕作技术体系提供理论依据。主要结论如下:（1）免耕提高了表层土0-5 cm大多数的土壤化学指标p H、SOC、TN、DOC、DON、NO3-N、NH4-N、TP、AP、TK、AK和微生物指标MBC、MBN、BR、q MIC、q CO2以及土壤有机碳组分LF、POC、f POC、MOC的含量。另外,免耕处理土壤有机碳储量增加。综上所述,我们建议免耕农田应该每隔几年翻耕一次,使表土及底土混匀。本研究为东北冷凉地区的土壤改良提供了理论指导。（2）NT5处理显著提高了土壤细菌的丰度。传统耕作两个深度之间的共有OUT数量多于免耕处理。免耕和传统耕作中细菌的优势菌门包括变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门和浮霉菌门等。NT5处理Chao 1和Shannon指数显著高于NT20处理。NMDS分析表明免耕和传统耕作两个深度的土壤细菌群落都形成各自的聚类分布,表层土壤细菌群落的多样性和组成与下层有显著的差异。NT5处理的指示物种为Lautropia。细胞外结构、转录、辅酶的运输和代谢、次生代谢产物生物合成、运输和分解代谢、细胞周期控制、细胞分裂、染色体分割、能源生产与转换、脂质转运与代谢、细胞骨架在免耕两个深度下有显著变化。与C、N有关的优势功能菌Arenimonas、Devosia、Ferruginibacter、Flavobacterium、Hyphomicrobium、Mesorhizobium、Oryzihumus、Pedomicrobium、Segetibacter和Tumebacillus的相对丰度在NT5和NT20之间有显著差异,在CT5和CT20之间没有差异。结构方程模型显示耕作和土壤深度解释了细菌群落88%的多样性和82%的组成,耕作和土壤深度通过BD、p H和SOC对物种多样性和组成有显著的间接影响。综上所述,本研究认为在免耕土壤中如果仅仅取0-20 cm一层,可能会掩盖了土壤上下层之间细菌群落多样性和组成的差异。本试验的研究结果加深了对保护性耕作在改变土壤细菌群落结构中的作用的认识和对土壤理化性质驱动细菌群落结构的理解。（3）NT20的真菌基因拷贝数显著低于其它处理。免耕和传统耕作中真菌的优势菌门包括子囊菌门、接合菌门、担子菌门和罗兹菌门等,优势属包括被孢霉菌、普兰久浩酵母和木霉镰刀菌等。Chao 1和Shannon指数在NT5处理显著高于NT20,CT5和CT20之间没有差异。免耕和传统耕作0-5 cm和5-20 cm两个深度的真菌群落组成可以很好地形成聚类分布。免耕改变了土壤真菌多样性和组成,并且真菌多样性和组成随土壤深度而变化。NT5的指示物种为Coniochaetales＿sp。大部分潜在的致病菌相对丰度在NT5显著高于NT20,而CT5和CT20之间没有显著差异,但潜在的有益菌没有一致的趋势。结构方程模型表明耕作和土壤深度可以解释真菌群落的64%多样性和95%组成。耕作方式和土壤深度通过影响土壤有机碳、p H和容重间接改变了土壤真菌的多样性和组成。（4）免耕和传统耕作土壤固氮菌在门水平上变形菌门相对丰度最大。属水平上慢生根瘤菌属的相对丰度最大,其次是未分类细菌属和地杆菌属等。慢生根瘤菌属在所有处理中差异不显著。耕作、土壤深度对nif H基因拷贝数、Chao 1和Shannon指数无显著影响,PCo A分析表明免耕和传统耕作土壤固氮菌群落的组成差异显著。所有土壤理化特征与nif H基因拷贝数、Chao 1和Shannon指数都没有显著相关性,土壤容重与PC1显著相关。Mantel Test检验表明固氮菌群落与土壤容重显著相关。本研究结果突出了土壤容重对免耕土壤固氮菌群落组成的重要作用,加深了我们对耕作方式和土壤深度对土壤固氮菌群落作用的理解。