论文部分内容阅读
目的:研究抑制急性早幼粒细胞白血病维甲酸耐药NB4-R1细胞PI3K/Akt信号通路后,NB4-R1细胞对他米巴罗汀(Am80)、全反式维甲酸(ATRA)敏感性改变,探讨PI3K/Akt信号通路与急性早幼粒细胞白血病细胞耐药株NB4-R1细胞分化的相关性,为寻找APL分化机理及克服耐药提供新的思路。方法:使用PI3K/Akt抑制剂CAL-101处理NB4-R1细胞,不同药物浓度(3μmol/L、5μmol/L、7μmol/L、9μmol/L、12μmol/L)处理72h和9μmol/L CAL-101处理不同时间(24h、48h、72h、96h、120h),实时荧光定量(Quantative Real-time PCR)、Western blot检测PI3KCA、Akt1基因与蛋白表达量的改变。NB4-R1细胞分为空白组、溶剂组(无水乙醇、DMSO)、ATAR组、ATRA+CAL-101组,Am80组,Am80+CAL-101组(Am80和ATRA药物浓度为30μmol/L、CAL-101为9μmol/L)与细胞共培养48h、96h、144h后,瑞氏染色观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD11b、CD13、CD16表达,实时荧光定量(Quantative Real-time PCR)检测PML-RARα融合基因的mRNA表达水平。结果:1、CAL-101有效抑制NB4-R1细胞PI3KCA、Akt1基因及蛋白表达,其抑制程度与CAL-101浓度升高呈正相关(P<0.05)。72小时9μmol/L CAL-101抑制PICKCA基因相对表达率为(0.437±0.025);3μmol/L CAL-101抑制Akt1基因的相对表达率为(0.525±0.043)。9μmol/L的CAL-101作用72h Akt1基因相对表达率为(0.114±0.025),9μmol/L组Akt1蛋白表达量较空白组(0.195±0.037)VS(1.672±0.103)显著降低(p<0.05)。2、9μmol/L CAL-101作用于NB4-R1细胞株不同时间,PI3KCA、Akt1基因及蛋白表达下降水平与作用时间呈正相关。PI3KCA基因表达量24h组较对照组差异不显著(P>0.05),48h组较空白组降低(P<0.05);Akt1基因相对表达量各药物组与对照组比较均显著下降(P<0.05)。PI3K p110δ蛋白量24h组较空白组、48h组较空白组差异不显著(P>0.05);Akt1蛋白量各药物组较空白组显著下降(p<0.05)。24h、48h、72h组Akt蛋白表达量分别为(0.816±0.059)、(0.531±0.022)、(0.311±0.107)。3、形态学观察发现atar组,atar+cal-101组,am80组,am80+cal-101组,空白组,溶剂组48h均未见nb4-r1细胞形态发生了明显变化,96小时各药物组均可见大量中、晚幼粒细胞,144h各药物组大部分细胞均已分化成熟,同时间段cal-101+atra、cal-101+am80组细胞分化成熟更明显。4、细胞表面分化抗原随着药物作用时间的延长,cd13表达逐渐下降,cd11b、cd16表达逐渐上升。48h各药物组cd11b均未见明显表达,与空白组比较差异无统计学意义(p>0.05);各药物组cd13阳性表达率较空白组降低(p<0.05),各药物组间相互比较差异无统计学意义(p>0.05);48h各药物组较空白组cd16阳性细胞表达率差异无统计学意义(p>0.05)。96h各药物组较空白组cd11b阳性表达率显著升高(p<0.05),两组之间相互比较,双药物组较单药物组表达率升高(p<0.05);各药物组cd13阳性表达率趋近于零,cal-101+am80组较am80、cal-101+atra组较atra组表达率高(p<0.05);各药物组较空白组cd16阳性表达率显著升高(p<0.05),双药物组较单药物组表达升高(p<0.05)。144h各药物组cd11b阳性表达率接近最大值,am80组较atra组、am80+cal-101组较am80组、atra+cal-101组atra组cd11b阳性表达率升高(p<0.05),其它各药物组之间差异均无统计学意义(p>0.05);cd13阳性表达率于零,各药物组差异无统计学意义(p>0.05);cd16阳性表达率cal-101+am80组较cal-101+atra组、am80组较atra组表达升高(p<0.05)。5、pml-rarα基因表达水平随着药物作用时间逐渐下降,双药物组最显著。48h各药物组pml-rarα基因相对表达量较空白组表达下降(p<0.05),am80组较atra组、cal-101+am80组较am80组、cal-101+atra组较atra组基因表达下降(p<0.05)。96hcal-101+am80组较am80组、cal-101+atra组较atra组基因表达下降(p<0.05)。144hcal-101+am80组较am80组、cal-101+atra组较atra组基因表达下降(p<0.05)。结论1、CAL-101能抑制PI3K/Akt信号通路,降低PI3K、Akt基因及其蛋白表达量,其作用强度与浓度、作用时间呈正相关。2、Am80可有效诱导NB4-R1细胞分化,诱导分化效应较ATRA有效。3、抑制PI3K/Alt信号通路后NB4-R1细胞对Am80、ATRA的敏感性上升,细胞表面分化抗原CD11b、CD16表达增高、CD13表达降低。4、抑制PI3K/Akt信号通路后可协同Am80、ATRA降低PML-RARα基因表达。5、PI3K/Akt信号通路的激活抑制NB4-R1细胞分化。