目的:由成釉细胞分泌的釉基质蛋白与牙釉质的形成密切相关,其也被证明能够促进牙周相关细胞的增殖与成骨分化。釉原蛋白(Amelogenin,Am)是釉基质蛋白的主要成分,国外已成功将猪釉原蛋白开发为牙周病治疗的上市药物。天然釉原蛋白须从牙胚中提取,且提取率低,因此重组釉原蛋白成为研究新趋势。本课题组之前已成功构建出关于人全长釉原蛋白的原核表达系统,但表达效果不甚理想,本研究希望对其进行优化,并对获得的重组人全长釉原蛋白进行生物学功能的初步鉴定,为后续釉原蛋白的研究奠定基础。方法与结果:1.分别用PET-42a、PET-3c、PET-28a、Pmal-C4X质粒表达人Am基因,考虑表达量及标签因素后选用PET-28a作为最优载体。同时发现组氨酸标签的长度和位置能够影响rh Am的表达。将PET-28a-Am重组质粒中转化入大肠杆菌BL21中,通过培养基、温度、诱导时间,诱导剂浓度等条件优化,确定高表达可溶rh Am的条件为在TB培养基中,用0.5m M IPTG,28℃条件下诱导20h收样。2.分别采用金属离子亲和层析、离子交换层析和乙酸一步法三种方法纯化了带有N端组氨酸标签的rh Am蛋白,效果均不理想,最后选择用金属离子亲和层析纯化N端和C端都带有组氨酸标签的rh Am蛋白,成功获得rh Am蛋白。3.通过HS-5细胞和h PDLF细胞两株细胞来鉴定纯化的rh Am蛋白的细胞水平的生物学功能。结果表明,rh Am能够促进两株细胞的增殖、迁移,增强细胞内ALP活性,并刺激h PDLF细胞CollagenⅠ的生成,但对h PDLF细胞的粘附无明显影响。同时,rh Am能够显著抑制LPS诱导的h PDLF细胞中TNFα、IL-6和IL-1β的产生,表明rh Am具有一定的抗炎作用。且rh Am能够有效激活MKK3-P38 MAPK级联途径,表明rh Am可能也是通过此途径促进h PDLF细胞成骨分化。结论:本研究构建了重组人全长釉原蛋白的原核表达质粒,经过优化后得到能表达可溶rh Am的菌株。细胞实验表明纯化后的rh Am能够有效促进HS-5细胞和h PDLF细胞的生物学活性,并具有良好的抗炎活性,可作为釉原蛋白药物开发的候选者。