论文部分内容阅读
病原感染和宿主免疫是一个不断“博弈”的平衡过程,随着病原和宿主相互作用的进化,病原菌进化出一系列特有的策略,以躲避、抑制或者调控宿主先天免疫防御系统,如MAPK、NF-kB和炎症小体信号通路等。毒力分泌系统是细菌重要的感染元件,其介导的毒力因子转运是病原靶向宿主细胞先天免疫系统的关键,在促进细菌系统性感染和致病过程中扮演了重要角色。目前,在病原性细菌中,至少有六套毒力分泌系统被报道。这些毒力分泌系统是一种大分子分泌装置,可将蛋白、DNA或者其他类底物分泌到胞外或转运到宿主细胞内。四型分泌系统T4SS（Type ⅣV secretion system）作为细菌毒力的主要元件,具有遗传物质交换和效应蛋白转运两大关键功能。但是,目前对T4SS效应蛋白和在侵染过程中的功能还有待进一步阐明。杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiellapiscicida）是一种重要的水产养殖病原,在侵染巨噬细胞过程中能够调控某些关键基因的协同表达,产生抵御宿主免疫杀伤的适应性机制。当杀鱼爱德华氏菌感染宿主巨噬细胞后,能够在胞内增殖并引发宿主细胞焦亡,促进胞内菌逃逸到宿主细胞外,实现二次感染。本实验室早期通过杀鱼爱德华氏菌EIB202感染巨噬细胞模型发现,经过感染毒力驯化后的杀鱼爱德华氏菌的许多毒力关键基因表达均呈现上调趋势,而ETAE218（trxlp）编码基因在转录过程中上调表达异常明显。本论文首先对ETAE2186蛋白进行了晶体结构解析,采用同源建模发现,其特征为4个α螺旋和5个β折叠,以及氨基酸序列为WCXXC的酶活活性位点,是一种典型的硫氧还蛋白。我们将杀鱼爱德华氏菌ETAE2186编码的蛋白命名为Trx1p（Thioredoxin-1ike protein）。进一步分析Trx1p的氧化还原能力发现,与杀鱼爱德华氏菌中经典的硫氧还蛋白Trx1和Trx2相比,Trx1p的还原能力非常弱。我们进一步对Trx1p的表达和分泌进行研究,发现Trx1p蛋白能够通过T4SS被细菌分泌到培养基上清中。在HEK293T细胞中过表达Trx1p蛋白,发现ETAE2186定位在宿主细胞质中。我们鉴定了杀鱼爱德华氏菌的一个T4SS效应蛋白Trx1p,并对其在感染过程中发挥的功能进行深入探索。Trx1p具有细菌和哺乳动物硫氧还蛋白相同的三维结构和保守的WCXXC活性位点,在侵染过程中Trx1p可能被转运到宿主细胞后可以模拟内源性hTrx1蛋白发挥功能。通过相互作用实验发现,Trx1p模拟内源性hTrx1蛋白,与ASK1发生相互作用,抑制ASK1的N末端同源接触。经过哺乳动物细胞感染和蛋白过表达实验表明,Trx1p与ASK1结合后,可抑制ASK1-Erk1/2-和p38-MAPK信号通路的激活,Trx1p的WCXXC酶活位点是发挥该抑制作用的关键。我们选取了与哺乳动物免疫系统具有高度相关性的斑马鱼幼鱼为感染模型,进一步考察Trx1p在活体感染水平对细菌毒力的影响。通过ZF4细胞感染模型进一步证实Trx1p抑制ASK1-MAPK信号通路的激活。通过斑马鱼幼鱼感染模型,确定了 Trx1p对ASK1-Erk1/2和p38-MAPK通路的抑制效应,降低了斑马鱼幼鱼炎症因子的表达,导致宿主免疫防御能力下降,促进了细菌的定殖和系统性感染。