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第一部分肝细胞癌中双氧化酶1(Duoxl)的表达变化及其调控机制背景与目的：双氧化酶1(Dual oxidase 1, Duoxl)基因是NADPH氧化酶家族群中的一个关键成员,其主要功能是催化产生活性氧,与肿瘤的发生、发展密切相关。在肺癌和甲状腺癌的研究中显示,肿瘤组织中Duox1基因表达显著下调；在甲状腺癌中,其表达水平与肿瘤恶性程度相关。因此有学者认为Duox1可能是一个选择性的抑癌基因。在肺癌中Duox1表达下调机制的进一步研究中发现,癌组织中普遍存在Duox1启动子的高甲基化修饰,并论证了此为导致Duox1低表达的主要调控机制。Duox1基因在原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中研究甚少,是否也存在类似现象及调控机制,是否与HCC的恶性生物学特性相关,需进一步研究。本研究第一部分旨在明确Duox1在HCC中的表达情况及与肝细胞癌恶性程度的相关性,并尝试阐明启动子区的甲基化可否调控其在HCC中的表达水平。方法：1.选取8株肝癌细胞系(HepG2、Hep3B、Huh7、SMMC-7721、 MHCC-97H、MHCC-97L、BEL-7402、HCC-LM3),以1株正常肝细胞系(L02)作为对照。同时筛选20例术后病理证实为原发性肝细胞癌患者的肿瘤组织,以相应癌旁非瘤组织(距肿瘤组织切缘≥2cm)作为对照组,其中Edmondson组织学分级Ⅰ级6例,Ⅱ级8例,Ⅲ级6例,TNM分期Ⅰ期6例,Ⅱ期6例,Ⅲ～Ⅳ期8例。Real-timePCR检测Duox1 mRNA表达水平。分析肝癌细胞系/正常肝细胞系及肿瘤组织/癌旁组织中Duox1 mRNA水平的表达差异,并进一步分析Duox1 mRNA的表达水平与肿瘤分级分期的关系。2. 为明确Duox1在肝细胞癌中的表达调控机制,使用去甲基化药物5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC)连续处理8株肝癌细胞系3天后重新检测Duox1 mRNA的表达水平(试验重复3次)。并通过甲基化特异性PCR (Methylation specific PCR, MSP)检测肝癌细胞系及原发性肝细胞癌组织／癌旁组织中Duox1启动子的甲基化水平。进一步分析Duox1启动子甲基化与Duox1表达水平的相关性。结果：1.6/8株肝癌细胞系中Duox1mRNA的表达水平显著低于正常肝细胞系。2. 原发性肝细胞癌组织中Duox1 mRNA的表达水平(3.386±0.841)显著低于癌旁组织(17.5±3.907)(P=0.001)。组织学分级为Ⅰ级的肿瘤组织Duox1的表达水平(6.916±-1.984)显著高于Ⅱ(2.496±0.767)、Ⅲ(1.042±0.345)级中Duox1的表达(P<0.05),Ⅱ级肿瘤组织中Duox1的表达有高于Ⅲ级肿瘤组织中Duox1表达的趋势,但差异无统计学意义(P=0.0806)。Duox1的表达水平与肿瘤TNM分期无明显相关性(P>0.05)。3. 用去甲基化药物处理8株肝癌细胞系后,6株肝癌细胞系中Duox1 mRNA的表达显著上调。4.6株低表达Duox1的肝癌细胞系中均存在该基因启动子的高甲基化修饰。1株高表达Duox1的肝癌细胞系HepG2中检测到了该基因启动子的部分甲基化修饰。另1株高表达Duox1的肝癌细胞系Hep3B中未检测到Duox1启动子的高甲基化修饰。5. 原发性肝细胞癌组织中Duox1启动子的甲基化发生率(90%)显著高于癌旁组织(25%)(P<0.0001)。Duox1低表达的肿瘤组织中普遍存在Duox1启动子的高甲基化修饰。结论：在肝细胞癌中,启动子区DNA甲基化修饰是导致Duox1表达下调的主要调控机制。Duox1的表达下调可能促进了肝细胞癌的发生,但与肝癌的转移可能无关。第二部分Duoxl对肝癌细胞增殖的影响背景与目的：Duoxl所属的NADPH氧化酶家族是细胞内非线粒体活性氧的主要来源。近年来越来越多的研究显示,活性氧在细胞内可作为第二信使,调节细胞增殖、分化及凋亡,’从而限制肿瘤的生长。且有研究显示,在肺癌中,Duoxl可通过增加胞内活性氧的生成,维持气道上皮细胞稳态,促进细胞的修复从而发挥抑癌基因作用。基于我们在第一部分的研究中发现了Duoxl的下调与HCC组织学分级呈负相关趋势,提示该基因的表达下调可能促进了HCC的发生。但迄今为止,Duoxl在HCC中的作用及具体机制尚未见报道。因此本研究第二部分旨在通过体外细胞实验探讨其对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及其潜在的分子机制。方法：1.将Rho-HA-Duoxl-pcDNA3和DuoxAl-Myc-pcDNA3.1的质粒共转染低表达Duoxl的肝癌细胞系SMMC-7721,以pcDNA3空质粒转染该细胞系作为对照组。Western blot验证转染效率。后经G418选择后行单层细胞集落形成能力检测。用MTS法检测细胞生长能力。2. 将Duox1特异性的小干扰RNA (Small interfering RNA, siRNA)转染高表达Duox1的Hep3B细胞系,以转染了阴性对照siRNA的Hep3B细胞系作为对照。RT-PCR验证转染效率,MTS法检测两组细胞的细胞生长能力。3. 将Rho-HA-Duox1-pcDNA3和DuoxA1-Myc-pcDNA3.1的质粒共转染低表达Duox1的肝癌细胞系SMMC-7721,以pcDNA3空质粒转染该细胞系作为对照组。流式细胞术检测两组细胞的细胞周期进程。结果：1. 在肝癌细胞系SMMC-7721中过表达Duox1后细胞集落形成能力下降,细胞生长能力明显减弱(P<0.05)；2. 在肝癌细胞系Hep3B中下调Duox1的表达后细胞生长能力显著增强(P<0.05)；3. 在肝癌细胞系SMMC-7721中过表达Duox1后,停留在G2/M期的细胞数(53.33%)较对照组明显增多(35.07%)(P<0.05)。结论：Duox1可通过阻滞细胞周期进程而抑制肝癌细胞增殖,提示在肝细胞癌中Duox1可能发挥了抑癌基因的作用。