背景与目的:胶质瘤是成人颅内最常见的原发恶性肿瘤,预后极差。目前,手术结合放化疗的综合治疗方案被广泛运用于临床胶质瘤的治疗,但治疗效果并不理想,接受手术治疗的胶质瘤呈现高复发的现象,而且预后也极差。其中,多形性胶质母细胞瘤（GBM）患者的平均生存期在诊断后仅约15个月。赖氨酰氧化酶（LOX）家族的蛋白质是分泌型的氨基氧化酶,该家族成员的共同功能是能共价交联细胞外基质中的胶原蛋白和弹性蛋白;该项功能使LOX家族蛋白在维持组织结构的完整性方面具有不可替代的作用。虽然赖氨酰氧化酶样蛋白2（Lysyl-oxidase-like-2,LOXL2）也具有上述功能,但其也有其特有的功能。有研究证实了LOXL2能调节细胞外和细胞内细胞信号通路。LOXL2的异常表达或激活与许多疾病有关,包括纤维化和心脏病。LOXL2在肿瘤中的表达水平和功能取决于肿瘤源发组织类型。尽管已有研究报道在卵巢肿瘤中LOXL2呈低表达状态,但是在结肠和食道肿瘤,口腔、喉和头颈鳞状细胞癌中,LOXL2呈高表达状态且与肿瘤患者的不良预后相关。此外,LOXL2还能促进胃癌和乳腺癌细胞的转移。但是,LOXL2基因在胶质瘤中的作用仍不清楚。替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）是临床用于治疗胶质瘤的一线药物。TMZ的最终功效根据胶质瘤内在和获得性耐药性而变化。因此,TMZ耐药性是影响TMZ在胶质瘤治疗疗效方面的主要障碍,对TMZ耐药性的研究对于恢复疗效和减轻患者痛苦至关重要。自噬是真核细胞通过溶酶体介导的降解性生物学过程,它具有高度保守性。研究表明自噬在机体的生存,分化,发育等方面发挥着至关重要的作用。在肿瘤中,自噬却具有双重角色。在肿瘤发生的早期阶段,自噬可以通过抑制活性氧（ROS）,DNA损伤,组织损伤,炎症和基因组不稳定性等肿瘤诱发因素来抑制肿瘤的发生;但在成熟的肿瘤中,自噬能通过增强肿瘤细胞对恶劣环境因素的耐受性来增强肿瘤细胞的存活,迁移,侵袭以及对治疗的抵抗性。在胶质瘤中,自噬不仅会降低胶质瘤细胞对TMZ的敏感性,还会改变其他过程来增加恶性表型,例如上皮到间质（样）转变（EMT）。但是,自噬对胶质瘤的EMT过程以及TMZ敏感性的内在具体调控机制目前尚不清楚。在本研究中,我们首先分析了LOXL2在TCGA（The Cancer Genome Atlas,TCGA）,CGGA（Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA）,GSE16011和REMBRANDT（the Repository for Molecular Brain Neoplasia Data,REMBRANDT）中的表达和预后意义,然后研究了其在肿瘤发生中的作用以及其对胶质瘤TMZ的耐药性的调控作用。我们的研究结果表明,LOXL2能促进胶质瘤的发生发展并促进胶质瘤对TMZ的抵抗,其可能构成神经胶质瘤患者的新治疗靶点。研究方法:1.生物信息学分析通过c Bio Portal for Cancer Genomics（http://www.cbioportal.org/）获得来自TCGA的GBM和低级别胶质瘤（LGG）患者的基因表达数据和临床相关数据。用Kaplan-Meier生存曲线和对数秩检验评估比较不同患者的总体生存差异。有关GBM的无进展生存数据来自TCGA GBM的Affymetrix阵列数据。CGGA数据库（http://www.cgga.org.cn）的m RNA表达数据和临床资料自官网下载。来自m RNAseq＿693的数据用于化疗相关的生存分析。使用m RNAseq＿325数据进行其他分析。GSE16011基因表达原始数据和病例对应的临床信息是从GEO（Gene Expression Omnibus,GEO）数据库下载而来。其中基因表达的原始数据使用affy R包的多阵列分析（RMA）方法进行背景矫正和归一化处理。从Glio Vis网站（http://gliovis.bioinfo.cnio.es）下载REMBRANDT的基因表达数据和临床信息。GSE43107患者样品是在III期随机临床试验EORTC26951中收集的,该试验研究了间变性少突胶质神经胶质瘤中辅助前卡巴嗪（procarbazine）,CCNU（洛莫司汀）和长春新碱（PCV）化疗的情况。其中,有45个样本来自HU133plus 2.0阵列,而有95个样本来自外显子阵列（Hu Ex＿1.0＿st阵列）。由于这两个平台之间的显着差异,我们仅挑选了来自外显子阵列的样品。通过GEO数据库获得原始基因表达数据和临床信息。使用Oligo R包处理原始数据,RMA方法用于背景校正和标准化。2.临床病理标本本研究方案经中国医科大学伦理委员会批准通过。所有患者均已签署书面知情同意书。从2016年至2018年在中国医科大学附属第一医院收集了56例胶质瘤患者的临床样本。在同一时期,还从另外6名无任何先前神经系统疾病的患者中抽取了样本,这些患者曾遭受严重的脑外伤并立即接受了手术。所有入选患者均接受了根治性手术切除,而没事先接受化疗或放疗。3.细胞培养和试剂人胶质瘤细胞系U373,U251和U87和人正常星形胶质细胞（Normal human Astrocyte,NHA）购自中国科学院细胞库。T98细胞株是从美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection,ATCC,马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国）购买。LN229细胞由姜涛（北京神经外科研究所）提供。所有细胞系均在含有10%胎牛血清（FBS）,1%的青霉素（100 U/m L）和链霉素（100 U/m L）的高糖DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM;Hyclone,Logan,UT,USA）培养基中作为单层细胞进行培养,并在37℃,5%二氧化碳的潮湿环境中孵育。4.q-PCR实验TRIzol（Invitrogen,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国）被用来分离提取总RNA。使用Prime-Script RT Master Mix（Takara Bio Inc.,Shiga,Japan）合成单链c DNA,然后使用SYBR Green Master Mix进行q PCR检测（PCRLight Cycler（?）480;Roche Diagnostics Ltd.,Basel,Switzerland,Ta Kara）。每个样品进行三次重复测试。每个样品的熔解曲线分析用于评估扩增特异性。使用2-ΔΔCt方法计算相对基因表达水平。5.迁移和侵袭检测采用划痕实验确定胶质瘤细胞的迁移能力,并使用Image J（美国马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院）进行定量。使用基质胶包被的transwell测定法（Corning,8μm;Corning,NY,美国）确定侵袭潜能。将含有2%FBS的DMEM细胞悬液添加到上部孔中,并将含有20%FBS的DMEM作为趋化剂添加到下部孔中。孵育20小时待细胞穿过基质胶涂层进入到小室底面后收集小室,固定、染色细胞并计数。6.蛋白质印迹实验收获细胞或组织碎片并用蛋白质提取剂（Beyotime,北京,中国）裂解。使用双辛可宁酸（BCA）方法定量总蛋白。在每个泳道中,每个样品上样25–50μg,用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳,并将电泳分离的蛋白转印到PVDF膜上（0.45μm,Millipore）。用TBST配制的5%脱脂奶粉封闭溶液封闭1小时后,将膜与目标蛋白对应的抗体在4℃孵育16小时。一抗孵育完毕后将膜用TBST清洗三遍并在20℃条件下孵育对应的二抗2小时。使用增强的化学发光试剂（Beyotime）和Chemi Doc?Touch检测系统（Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,美国）并用Image J软件对免疫反应蛋白进行定量。7.细胞克隆实验,细胞增殖和细胞毒性测定克隆实验按如下操作进行:将细胞接种到6孔板中（每孔1000个细胞）,孵育约2周。当单个细胞集落显示大于50个细胞时,用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤并用结晶紫染色溶液染色。Cell Titer 96（?）AQueous Non-Radioactive cell proliferation assay kit（Promega,麦迪逊,威斯康星州,美国）被用来评估细胞增殖。配制1,000个细胞/100μL的细胞悬液并以每孔100μL的量接种到96孔板中,每天一次,连续检测5天。对于细胞毒性测定,细胞悬液的密度为5,000细胞/100μL,每孔同样100μL,培养三天。使用酶标仪在490 nm处测量吸光度。计算每个时间点对对照组的光密度值的百分比作为细胞活力。8.透射电子显微镜将收集到的细胞浸泡于2%戊二醛中持续2小时以固定细胞。然后将细胞转移到1%的四氧化锇中。经上述处理后细胞会在梯度乙醇中脱水。然后将细胞包埋切片并用柠檬酸铅染色。最后在透射电镜（H-7650,日本日立）下观察。9.凋亡分析使用Annexin V PE/7-AAD双重染色凋亡检测试剂盒（BD Pharmingen Inc.,圣地亚哥,CA,美国）测定细胞凋亡。简而言之,收获3×105个细胞经冷PBS洗涤后悬浮于1×结合缓冲液中。用5μL Annexin V/PE和10μL 7ADD对105个细胞的等分试样进行染色。通过流式细胞仪分析染色的细胞。10.si RNA,质粒和慢病毒的构建特异性靶向人LOXL2,ERK1/2和ATG7的小干扰RNA（si RNA）从Sangon Biotech（中国上海）获得。LOXL2过表达质粒获自Gene Chem（中国上海）,以相应的空载体（EV）作为对照。将细胞在6孔板上培养至80%-90%汇合,并根据制造商的说明使用Lipofectamine 3000试剂（Invitrogen）作为转染试剂,配以si RNA,质粒或阴性对照转染。带有LOXL2 si RNA序列的慢病毒是从Genechem获得的。嘌呤霉素（10μg/ml）用于筛选出稳定转染慢病毒的细胞。11.统计分析所有统计分析均使用Graph Pad Prism 6.0版（Graph Pad Software,美国加利福尼亚州圣地亚哥）和SPSS 16.0版（SPSS Inc.,美国伊利诺伊州芝加哥）进行。数据表示为平均值±SEM或SD。在适用的情况下,采用单向方差分析,双尾t检验和对数秩检验。生存分布通过Kaplan-Meier方法计算。除非另有说明,否则P<0.05被认为具有统计学意义。结果:1.LOXL2在胶质瘤中表达水平显著高于其在非肿瘤脑组织中的表达水平。并且,LOXL2表达与胶质瘤级别、IDH突变情况以及胶质瘤恶性亚型显著相关。此外,LOXL2表达还与胶质瘤预后相关,LOXL2表达越高,患者预后越差;2.在胶质瘤细胞系中,LOXL2表达显著高于人正常星形细胞（NHA）;此外LXOL2的表达水平还与化疗预后相关。3.LOXL2能够促进胶质瘤的增殖、迁移、侵袭以及EMT过程,并促进胶质瘤细胞的TMZ耐受;3.1沉默LOXL2能显著抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭,并影响EMT相关蛋白的表达,增强胶质瘤细胞对TMZ的敏感型;3.2过表达LOXL2能显著促进胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭,EMT相关蛋白的表达与敲除LOXL2呈相反趋势,胶质瘤细胞对TMZ的敏感性也降低;4.LOXL2能够促进胶质瘤细胞自噬的活化,过表达LOXL2能促进自噬,相反敲除LOXL2能抑制自噬,此外在过表达LOXL2同时用自噬抑制剂氯喹处理胶质瘤细胞能逆转LOXL2对EMT以及TMZ敏感性的调控作用;5.LOXL2对自噬的调控是通过调控ATG7的表达实现的;6.LOXL2通过促进ERK1/2的磷酸化来促进ATG7的表达,从而对自噬产生调控作用。7.在体实验验证了LOXL2的作用结论:LOXL2作为胶质瘤的预后因素,对胶质瘤的增殖、迁移、侵袭、EMT以及化疗敏感性都存在调控作用。LOXL2产生上述作用主要通过ERK1/2-ATG7调控胶质瘤细胞自噬过程实现。LOXL2可能成为胶质瘤治疗的潜在靶点。