【摘 要】
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背景:肺癌是全世界最常见和致命的癌症之一,其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌病例的85%。许多NSCLC患者被确诊时已处晚期。目前,晚期和转移性NSCLC患者的治疗方法十分有限。因此迫切需要发现用于早期诊断的生物标志物和新的治疗靶标。长非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA,众所周知,其可调节各种基因的表达,从而参与肿瘤的发生和发展。例如,lncRNA转移相
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背景:肺癌是全世界最常见和致命的癌症之一,其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌病例的85%。许多NSCLC患者被确诊时已处晚期。目前,晚期和转移性NSCLC患者的治疗方法十分有限。因此迫切需要发现用于早期诊断的生物标志物和新的治疗靶标。长非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA,众所周知,其可调节各种基因的表达,从而参与肿瘤的发生和发展。例如,lncRNA转移相关的肺腺癌转录本1（MALAT1）通过调节miRNA促进NSCLC的进展。但是目前尚未完全阐明MALAT1在NSCLC中的作用机制。目的:本研究目的在于探究MALAT1对NSCLC细胞生物学特性和糖酵解的影响,并探讨其分子机制是否与调控miR-515-5p/TRIM65有关,以期为NSCLC的诊断和治疗提供实验基础。方法:1、采用qRT-PCR技术检测NSCLC组织和细胞系MALAT1和LOXL1-AS1的表达情况,通过脂质体转染技术将MALAT1或LOXL1-AS1 si RNA转染至A549和SPC-A-1细胞。2、qRT-PCR技术检测转染效果,MTT实验、平板克隆实验检测细胞增殖和克隆形成能力。3、采用流式细胞术和Annexin V-FITC/PI双染色法检测干扰MALAT1或LOXL1-AS1对A549和SPC-A-1细胞周期和凋亡的影响。4、采用Transwell实验、划痕实验、Western blot检测以及试剂盒检测干扰MALAT1或LOXL1-AS1对A549和SPC-A-1细胞侵袭、迁移、上皮-间质转化和糖酵解的影响。5、构建同时干扰MALAT1和过表达TRIM65的A549和SPC-A-1细胞株,通过MTT实验、克隆形成、流式细胞术、Transwell等实验分析过表达TRIM65是否能回复干扰MALAT1对A549和SPC-A-1细胞增殖、细胞周期、凋亡、侵袭、迁移、上皮-间质转化以及糖酵解的影响。6、生物信息学在线数据库Starbase预测MALAT1和miR-515-5p以及miR-515-5p和TRIM65之间靶向结合位点,采用双荧光素酶报告基因实验、RIP实验和qRT-PCR技术验证MALAT1和miR-515-5p以及miR-515-5p和TRIM65靶向结合关系。7、分别采用qRT-PCR技术和Western blot检测miR-515-5p和TRIM65在NSCLC组织和细胞中的表达情况,并分析MALAT1、miR-515-5p和TRIM65在NSCLC组织中表达相关性。8、通过Western blot检测在NSCLC细胞中MALAT1是否能够通过miR-515-5p调控TRIM65的表达。9、裸鼠移植瘤实验证实lncRNA MALAT1通过miR-515-5p/TRIM65轴参与调控NSCLC的进展。结果:1、MALAT1和LOXL1-AS1在NSCLC组织和细胞系中呈高表达,转染MALAT1或LOXL1-AS1 si RNA能够有效干扰A549和SPC-A-1细胞中MALAT1和LOXL1-AS1的表达。2、干扰MALAT1或LOXL1-AS1能够抑制A549和SPC-A-1细胞增殖、细胞周期进程、克隆形成、侵袭、迁移、上皮-间质转化和糖酵解,并促进细胞凋亡。3、过表达TRIM65能够逆转干扰MALAT1对A549和SPC-A-1细胞生物学特性和糖酵解的影响。4、MALAT1能够靶向负调控miR-515-5p的表达,且miR-515-5p能够靶向负调控TRIM65的表达。5、MALAT1和miR-515-5p以及miR-515-5p和TRIM65在NSCLC组织中的表达呈负相关,MALAT1和TRIM65在NSCLC组织中的表达正相关。6、在NSCLC细胞中MALAT1能够通过miR-515-5p调控TRIM65的表达。7、裸鼠移植瘤实验证实lncRNA MALAT1通过miR-515-5p/TRIM65轴参与调控NSCLC的进展。结论:1、MALAT1和LOXL1-AS1在NSCLC组织和细胞中呈高表达,干扰MALAT1或LOXL1-AS1能够抑制NSCLC细胞生长、转移及糖酵解。2、MALAT1可作为miR-515-5p的ce RNA竞争性结合miR-515-5p,进而调控下游基因TRIM65的表达。3、MALAT1可通过调控miR-515-5p/TRIM65轴介导NSCLC细胞生物学特性和糖酵解,参与促进NSCLC的进展。
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