真菌漆酶在非水介质中的催化特性及其用于偶联聚合的研究

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漆酶(苯二酚:氧氧化还原酶,EC1.10.3.2)是一类在自然界中广泛分布的含铜多酚氧化酶,能直接催化酚类、芳胺类等多种有机底物发生氧化反应。真菌漆酶的可获得量较大,氧化还原电势较高,纯化相对简单,是当前科学界研究的热点。随着生物化工产业的兴起,越来越多的学者致力于研发酶催化有机合成技术。凭借其条件温和、选择性高、环境友好等特点,漆酶催化合成有望成为制备绿色和功能化聚酚、聚氨、功能化杂合物的主要工业途径。本论文以一株产高活性漆酶的白腐菌Panus conchatus为研究对象,研究所产漆酶的结构和性质。论证了丙酮对ABTS(2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐)的消除作用,还研究了漆酶催化合成2,3-二氨基酚嗪和木质素水凝胶,拓宽了漆酶的应用领域和提高了木质素的利用价值。分析了固体培养得到的P. conchatus漆酶的结构和性质,对氨基酸序列、金属催化中心、底物特异性进行了深入的研究,结果表明,从Panus conchatus提纯的漆酶表现出白色而非典型的蓝色特征,其催化活性中心的金属离子为2Cu/Zn/Fe,两个Cu离子和构成的双铜中心,这与典型的蓝色漆酶的TIIICu离子相同。TI和TIICu离子被Zn和Fe离子代替。P. conchatus漆酶的分子量为56kDa,等电点为3.6,氨基酸以酪氨酸为主,N-末端序列与担子菌漆酶接近,对ABTS具有较高的亲和力(Km=11.6μmol/L),对温度和pH表现出良好的稳定性,特别在较宽的pH范围内(4-12)保持活力的稳定。用紫外分光光度法研究了该漆酶在水/溶剂中催化ABTS氧化过程。发现漆酶催化ABTS的氧化反应受到丙酮的抑制作用,表观初始反应速率随丙酮含量增大剧烈下降,米氏常数和最大反应速率按指数趋势增大或降低。丙酮消减ABTS自由基可作为解释上述抑制作用的补充机理。在80%丙酮/水混合溶剂中,95%的ABTS自由基在60min内回复到还原态,这种自由基消减在最初1min内最快,随时间速率下降。利用丙酮对自由基的消减作用,设计了一种使ABTS循环使用的技术,ABTS至少可以回收6次,每次回收都会伴随着23-30%的衰减,这一发现对设计新型低成本漆酶/ABTS催化体系具有重要意义。研究了使用真菌漆酶在有机/水混合体系催化氧化邻苯二胺(OP)生物合成2,3-二氨基酚嗪(DAP),使用了多种光谱技术对反应产物进行了表征(紫外,红外,二维核磁,质谱)。结果表明,使用真菌漆酶作为生物催化剂,利用OP合成了DAP。在温和并且氧气存在条件下,漆酶能够催化OP合成较高得率的DAP。产物DAP的结构通过紫外光谱、红外光谱、二维核磁共振光谱和质谱能到了确认。DAP粗产品产率为85%,提纯后最终DAP得率为63%,显著高于HRP催化合成。对SPORL处理桉木工艺控制的研究结果表明,升温时间主要控制粗渣的产生量,保温时间决定纤维的可水解性,预处理料的均匀性对纤维素酶解有重要的影响。桉木SPORL处理料进行水解,可以得到酶解木质素。在漆酶催化作用下,酶解木质素与壳聚糖、明胶、邻苯二酚共混形成水凝胶。该水凝胶吸水能力强,含0.2%木质素的试样能吸附自身重量47.2倍的水,并且木质素的存在能延缓水凝胶因加热而失水的过程。实验结果表明,制备的含木质素的水凝胶对ABTS的抗氧化能力超过92%,木质素可能参与ABTS自由基还原的反应。引入木质素也能提高水凝胶对牛血清蛋白的吸附量,最高可达63mgBSA/g,即使邻苯二酚含量下降,补充适量的木质素,也能改善其吸附性能。木质素水凝胶对漆酶酶活有很强的抑制能力,经木质素水凝胶处理,漆酶酶活力下降99.5%左右。
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