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漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,普遍存在于白腐菌中,具有降解木质素和使苯氧基类除草剂等有毒酚类物质无毒化的作用,还可去除石油工业废水的毒性。在造纸、饮料加工、和环保等方面具有广泛的应用前景。大多数白腐菌在水中的生长速度较慢,结球结块,仅能生活在水体表面,这些都限制了其在处理废水等方面的直接应用。克隆白腐菌漆酶的结构基因,对今后培育白腐菌漆酶基因大量表达的工程菌株和用工程菌处理酚类污染的废水等具有十分重要的意义。
本研究以白腐真菌D1为材料,检测了漆酶的活性,对白腐菌D1漆酶基因进行了克隆和序列分析,并构建了分泌型P.pastaris表达载体pPIC9K/Lcc,结果如下:
(1)应用显色反应对白腐真菌D1进行了漆酶活性测定,结果表明白腐菌D1具漆酶活性,且活性较强。
(2)建立快速提取高纯度完整丝状真菌RNA的方法。
(3)获得了白腐菌D1漆酶基因全长cDNA序列。通过RACE和GenomeWalking技术从白腐菌D1中扩增得到漆酶全长cDNA序列,共1910bp,包括完整的开放读码框1557bp,编码518个氨基酸。其5’非编码区为51bp,3’非编码区为302bp。其编码的氨基酸序列与朱红密孔菌漆酶的同源性为95%,与其他担子菌漆酶的同源性也很高。
(4)获得了白腐菌D1漆酶基因完整DNA序列。白腐菌D1漆酶基因全长的DNA序列2124bp,该序列除包含全部漆酶cDNA编码区外,还包括10个内含子序列,长度在52~70pb之间,遵循GT-AG规则,是典型的真核生物内含子,包括明显的5’端的供体剪切位点、3’端的受体剪切位点和分支点序列。
(5)构建了分泌型P.pastaris表达载体pPIC9K/Lcc。