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目的:近年来以白色念珠菌(Candida Albicans,CA)为主要致病菌的侵袭性真菌感染(Invasive fungal infections,IFIs)发病率逐年增高,给人类健康带来极大威胁。氟康唑(Fluconazole,FLC)作为临床一线用药,随着其广泛使用耐药率逐渐增高,为临床治疗带来困难。中药由于其作用靶点较多而不易产生耐药性,且具有毒副作用低、来源广泛、价格低廉等优势,成为目前新药开发的研究热点。高渗透性甘油促分裂原活化蛋白激酶信号通路(High-osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase pathway,HOG-MAPK)是白色念珠菌应对外界压力作出适应性反应最具代表性的一条通路,该通路调控了白色念珠菌对外界渗透及氧化压力的适应、细胞的形态转换及细胞壁的合成多个重要生理功能,可作为药物干预的潜在靶点。在前期研究中,我们发现中药黄连的主要活性成分盐酸小檗碱(Berberine Hydrochloride,BBH)对浮游及生物膜状态的白色念珠菌均有较好的抑制作用。因此本研究选择盐酸小檗碱为干预药物,通过分析药物对白色念珠菌HOG-MAPK通路五个功能及通路关键基因、蛋白表达的影响,初步探讨盐酸小檗碱对白色念珠菌的抑制作用及分子机制,为临床治疗耐药白色念珠菌感染提供新的思路和方法。方法:1.使用微量稀释法测定盐酸小檗碱、氟康唑抑制白色念珠菌生长的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC),确定盐酸小檗碱干预浓度(4MIC、MIC、1/4MIC),氟康唑对照干预浓度(4MIC)。2.盐酸小檗碱干预后,使用Trinder法测定白色念珠菌细胞内甘油含量、DCFH-DA荧光探针法测定活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平、化学发光法测定ATP含量、荧光染料法测定细胞壁几丁质和β-1,3-葡聚糖水平,倒置荧光显微镜观察白色念珠菌细胞内ROS水平、菌丝形成情况并计算芽管形成率,激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM)观察细胞壁几丁质暴露情况,研究盐酸小檗碱对白色念珠菌HOG-MAPK通路五个功能的影响。3.采用实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative-Polymerase Chain Reaction,RT-q PCR)检测盐酸小檗碱干预后HOG-MAPK中央信号通路关键基因(HOG1、PBS2、CHS3、GSC1)的表达,Western Blot技术检测白色念珠菌HOG1蛋白的表达水平,初步探讨盐酸小檗碱对白色念珠菌HOG-MAPK中央信号通路的分子调节机制。结果:1.14株氟康唑耐药白色念珠菌临床菌株及标准菌株ATCC 10231对盐酸小檗碱的MIC均为64μg/m L,ATCC 10231对氟康唑的MIC为1μg/m L。根据MIC值确定后续盐酸小檗碱干预浓度分别为256μg/m L、64μg/m L和16μg/m L,阳性对照氟康唑干预浓度为4μg/m L。2.对于细胞内渗透压:256μg/m L、64μg/m L盐酸小檗碱均能明显提高ATCC 10231和CA临床菌株细胞内甘油含量进而提高细胞渗透压,且256μg/m L盐酸小檗碱作用效果优于64μg/m L盐酸小檗碱和4μg/m L氟康唑(P<0.05),但16μg/m L盐酸小檗碱仅能提高ATCC 10231细胞内甘油含量(P<0.05)而对CA临床菌株无明显作用(P>0.05);同时,256μg/m L和16μg/m L盐酸小檗碱组ATCC 10231细胞内甘油含量高于CA临床菌株(P<0.05)。3.对于细胞内ROS水平:256μg/m L、64μg/m L盐酸小檗碱均能明显提高ATCC 10231和CA临床菌株细胞内ROS水平,且256μg/m L盐酸小檗碱作用效果优于64μg/m L盐酸小檗碱但不及4μg/m L氟康唑(P<0.05),16μg/m L盐酸小檗碱仅能提高ATCC 10231细胞内ROS水平(P<0.05)而对CA临床菌株无明显作用(P>0.05);同时,256μg/m L和64μg/m L盐酸小檗碱组CA临床菌株细胞内ROS水平高于ATCC 10231(P<0.05)。倒置荧光显微镜观察到细胞内荧光强度高低情况与DCFH-DA荧光探针法测定ROS检测结果一致。4.对于细胞内ATP含量:256μg/m L、64μg/m L盐酸小檗碱均能明显提高ATCC 10231和CA临床菌株细胞内ATP含量,且256μg/m L盐酸小檗碱作用效果优于64μg/m L盐酸小檗碱但不及4μg/m L氟康唑(P<0.05),16μg/m L盐酸小檗碱仅能提高ATCC 10231细胞内ATP含量(P<0.05)而对CA临床菌株无明显作用(P>0.05);同时,256μg/m L和64μg/m L盐酸小檗碱组ATCC 10231细胞内ATP含量高于CA临床菌株(P<0.05)。5.对于细胞形态转换情况:256μg/m L、64μg/m L盐酸小檗碱均能明显抑制ATCC 10231和CA临床菌株芽管的形成(P<0.05),16μg/m L盐酸小檗碱仅在4 h时能够抑制芽管形成(P<0.05)而在6 h时无明显抑制作用(P>0.05);同时,256μg/m L和64μg/m L盐酸小檗碱对ATCC 10231芽管形成的抑制效果优于CA临床菌株(P<0.05);256μg/m L、64μg/m L盐酸小檗碱均能明显抑制ATCC 10231和CA临床菌株菌丝的形成,且256μg/m L盐酸小檗碱抑制效果优于64μg/m L盐酸小檗碱及4μg/m L氟康唑,而16μg/m L盐酸小檗碱无明显抑制作用。6.对于细胞壁几丁质暴露情况:CLSM观察到256μg/m L、64μg/m L盐酸小檗碱组ATCC 10231和CA临床菌株细胞壁荧光强度均明显增强,且256μg/m L盐酸小檗碱组荧光强度高于4μg/m L氟康唑,16μg/m L盐酸小檗碱对细胞壁几丁质无明显作用;256μg/m L、64μg/m L盐酸小檗碱均能明显提高ATCC 10231和CA临床菌株细胞壁几丁质水平,且256μg/m L盐酸小檗碱作用效果优于64μg/m L盐酸小檗碱及4μg/m L氟康唑(P<0.05),16μg/m L盐酸小檗碱对细胞壁几丁质无明显作用(P>0.05);同时,256μg/m L和64μg/m L盐酸小檗碱组ATCC 10231细胞壁几丁质水平高于CA临床菌株(P<0.05)。7.对于细胞壁β-1,3-葡聚糖暴露情况:256μg/m L、64μg/m L盐酸小檗碱均能明显提高ATCC 10231和CA临床菌株细胞壁β-1,3-葡聚糖水平,且作用效果均优于4μg/m L氟康唑(P<0.05),16μg/m L盐酸小檗碱仅能提高ATCC 10231细胞壁β-1,3-葡聚糖水平(P<0.05)而对CA临床菌株无明显作用(P>0.05);同时,64μg/m L盐酸小檗碱组ATCC 10231细胞壁β-1,3-葡聚糖水平高于CA临床菌株,而256μg/m L盐酸小檗碱组ATCC 10231细胞壁β-1,3-葡聚糖水平低CA临床菌株(P<0.05)。8.对于HOG-MAPK中央信号通路关键基因表达的影响:256μg/m L、64μg/m L盐酸小檗碱均能明显上调ATCC 10231和CA临床菌株HOG1、PBS2的表达,下调GSC1的表达(P<0.05),效果优于4μg/m L氟康唑(P<0.05);256μg/m L盐酸小檗碱能明显下调ATCC 10231和CA临床菌株CHS3的表达(P<0.05),但64μg/m L盐酸小檗碱仅能下调CA临床菌株CHS3的表达(P<0.05)而对ATCC 10231 CHS3表达无明显影响(P>0.05),而16μg/m L盐酸小檗碱对上述基因的表达均无明显影响(P>0.05)。9.对于HOG-MAPK中央信号通路关键蛋白表达的影响:256μg/m L盐酸小檗碱能明显上调ATCC 10231和CA临床菌株HOG1蛋白的表达(P<0.05),与4μg/m L氟康唑效果无明显差异(P>0.05),64μg/m L、16μg/m L盐酸小檗碱对HOG1蛋白的表达无明显影响(P>0.05)。结论:1.盐酸小檗碱可通过影响HOG-MAPK通路五个功能对白色念珠菌发挥抑制作用,包括:增加细胞内甘油含量从而提高渗透压、增加ROS产生促进细胞氧化应激杀伤、促进线粒体呼吸代谢从而促进ROS产生、抑制芽管及菌丝形成阻碍形态转换、增加细胞壁几丁质和β-1,3-葡聚糖暴露破坏细胞壁完整性。2.盐酸小檗碱对白色念珠菌HOG-MAPK通路作用的分子机制可能与上调中央信号通路的核心基因HOG1、PBS2,下调效应基因CHS3、GSC1的表达,增加HOG1蛋白在细胞内的蓄积有关。但确切机制有待进一步深入研究。3.盐酸小檗碱对耐药临床菌株HOG-MAPK通路功能的作用效果整体上不及标准菌株,提示氟康唑耐药性的产生可能导致菌体多重耐药从而对其他药物抵抗使抑菌效果下降。其具体原因还需加大样本量做进一步研究。