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研究背景腹腔转移肿瘤是癌细胞经血道腹腔播散或腹膜直接种植生长所致,多继发于腹腔内胃、肝、结直肠、卵巢和胰腺的癌肿。该阶段病人病情进展迅速,预后差,临床治疗困难,多采用手术治疗联合化疗的方式。目前腹腔转移肿瘤患者由于缺乏有效的靶向治疗和免疫治疗方法,所以中位生存期仍然难以超过一年。因此寻找合适的靶向治疗靶点以及提供有效的免疫治疗策略对腹腔转移肿瘤的精准治疗至关重要。嵌合抗原受体T细胞疗法（Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy,CAR-T）是一种利用现代基因工程技术使患者T细胞表面表达肿瘤特异性嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor,CAR）,进而精准靶向肿瘤细胞并发挥抗肿瘤功能的新兴免疫细胞疗法。近些年,CAR-T细胞疗法除了在血液肿瘤中取得了令人鼓舞的疗效之外,越来越多的实体肿瘤治疗中也运用到了CAR-T细胞疗法并取得了一些突破性进展。人白介素21（Human Interleukin-21,h IL-21）是一种具有明显抗肿瘤潜力的多效性细胞因子,能够显著促进T细胞增殖和亚群分化,增强CAR-T细胞疗效。癌胚抗原细胞黏附因子6（Carcinoembryonic Antigen-related Cell Adhesion Molecule 6,CEACAM6）是一种表达于上皮细胞和髓样细胞表面的多功能细胞黏附蛋白,大量研究证实CEACAM6在胃癌、结直肠癌和胰腺癌等多种肿瘤中表达升高,且与肿瘤的恶性进展密切相关。最近我们研究发现CEACAM6在腹腔转移胃癌恶性腹水肿瘤细胞中高度富集。因此,开发、评估靶向CEACAM6 CAR-T细胞产品将有望为腹腔播散胃癌及其他肿瘤的治疗提供新的方案。目的寻找腹腔播散肿瘤的潜在治疗靶点,分析CEACAM6在肿瘤中的表达情况,构建表达靶向CEACAM6的CAR-T细胞及表达h IL-21的增强型CAR-T细胞,并评估其抗肿瘤活性。方法（1）单细胞测序分析腹腔转移肿瘤腹水细胞中基因表达差异。利用单细胞测序技术对来源于腹腔转移胃癌患者的腹水细胞进行测序并分析结果,寻找差异表达基因。（2）生物信息学分析差异表达基因CEACAM6在肿瘤中的表达。利用TCGA数据库中CEACAM6在癌和癌旁m RNA的表达数据,使用UALACAN在线网站进行生物信息学分析CEACAM6在癌和癌旁m RNA水平的表达差异;使用Human Protein Atlas数据库分析CEACAM6蛋白在正常组织和肿瘤组织中的表达情况。（3）构建并验证表达荧光素酶的稳转细胞系。利用流式细胞术分析不同肿瘤细胞系中CEACAM6的表达情况,选取高表达CEACAM6的肿瘤细胞系插入荧光素酶基因;利用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选;利用流式细胞术验证稳转细胞系构建情况;利用荧光素酶实验分析稳转细胞系细胞数量与荧光强度的相关性。（4）分析靶向CEACAM6 CAR-T细胞的抗肿瘤活性。利用现代分子克隆技术构建靶向CEACAM6 CAR分子慢病毒质粒;利用三代慢病毒包装系统制备靶向CEACAM6 CAR分子的慢病毒并侵染人T细胞制备靶向CEACAM6 CAR-T细胞;利用CAR-T细胞与肿瘤细胞共孵和荧光素酶实验验证CEACAM6 CAR-T细胞的抗肿瘤活性。（5）分析h IL-21对靶向CEACAM6 CAR-T细胞抗肿瘤活性的影响。利用基因工程等技术制备表达h IL-21的增强型CAR-T细胞;利用ELISA检测CAR-T细胞中h IL-21的分泌水平;利用CAR-T细胞和肿瘤细胞共孵观察细胞形态和杀伤情况;利用细胞计数检测h IL-21对CAR-T细胞增殖能力的影响;利用荧光素酶实验检测h IL-21对CAR-T细胞抗肿瘤活性的影响;利用ELISA检测CAR-T细胞体外杀伤过程中炎性细胞因子的释放情况;利用流式细胞术检测h IL-21分泌对CAR-T细胞亚群分化的影响。结果（1）恶性肿瘤腹水标本单细胞测序结果分析。单细胞测序分析结果显示,CEACAM6基因在腹腔转移胃癌患者的恶性腹水肿瘤细胞中高度富集。（2）生物信息学分析CEACAM6在肿瘤中的表达。UALACAN在线网络分析结果显示,CEACAM6在多种癌和癌旁组织m RNA水平存在差异表达。Human Protein Atlas数据库分析结果显示,CEACAM6蛋白在正常组织和肿瘤组织中存在一定表达。（3）构建并验证荧光素酶稳转细胞系。流式细胞术结果显示CEACAM6在多种肿瘤细胞系中高表达。选取高表达的细胞系ASPC1和AGS构建表达荧光素酶稳转细胞系,流式细胞术结果显示,成功构建并筛选出ASPC1-luc和AGS-luc稳转细胞系。荧光素酶实验结果显示,ASPC1-luc和AGS-luc稳转细胞系的细胞数量与荧光强度具有线性相关关系。（4）靶向CEACAM6 CAR-T细胞的抗肿瘤活性分析。酶切鉴定和测序序列比对结果显示,成功构建出靶向CEACAM6 CAR分子的慢病毒质粒。流式细胞术滴度测定结果显示,成功制备出靶向CEACAM6 CAR分子的慢病毒。流式细胞术检测CEACAM6 CAR-T细胞阳性率结果显示,成功制备出靶向CEACAM6的CAR-T细胞。肿瘤细胞与CEACAM6 CAR-T细胞共孵情况及荧光素酶实验检测CEACAM6 CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤情况,结果显示,CEACAM6 CAR-T细胞具有优越的抗肿瘤活性。（5）h IL-21对靶向CEACAM6 CAR-T细胞抗肿瘤活性的影响。测序序列比对结果、流式细胞术滴度测定结果、流式细胞术检测CAR-T细胞阳性率结果、Western blot检测CAR表达结果和ELISA检测h IL-21分泌水平结果显示,成功制备出表达h IL-21的CEACAM6 CAR-T细胞。CAR-T细胞与肿瘤细胞共孵结果图、荧光素酶实验检测CAR-T细胞体外杀伤肿瘤细胞结果及ELISA检测杀伤过程中炎性细胞因子释放结果显示,短时效内h IL-21对靶向CEACAM6CAR-T细胞抗肿瘤活性无明显影响。细胞计数结果显示,h IL-21对CAR-T细胞增殖能力无明显影响。流式细胞术检测CAR-T细胞亚型结果显示,h IL21-CEACAM6 CAR-T细胞能够通过分泌h IL-21进一步提高初始T细胞分化到记忆T细胞的比例,从而具有潜在增强CAR-T细胞抗肿瘤活性的功能。结论1.CEACAM6在腹腔转移肿瘤中高表达,可以作为潜在肿瘤免疫治疗靶点。2.靶向CEACAM6的CAR-T细胞具有优越的抗肿瘤活性。3.h IL-21具有潜在增强靶向CEACAM6 CAR-T细胞抗肿瘤活性的功能。