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体细胞核移植是一项复杂的胚胎工程技术,该技术操作环节过多是影响其总效率的一个重要因素,简化和规范化体细胞核移植操作程序是提高核移植效果的重要途径。本实验以猪卵丘细胞为供核细胞,对猪卵丘细胞核移植操作过程中的卵母细胞去核方法、核移植方式、核质作用时间以及其相关问题,如卵母细胞体外成熟培养等进行了研究,旨在探索一种适用于猪体细胞核移植的简单易行的供体细胞获得方法、去核方法、核移植方式、核质作用时间等操作技术。根据对实验数据的分析,得到以下几点结论: 1、猪体细胞核移植受体卵母细胞体外成熟培养研究:以改良的TCM199为基础培养液,以第一极体排出作为猪卵母细胞成熟标志,研究不同级别猪卵丘细胞-卵母细胞复合体(COCs)和不同培养基添加物对猪卵母细胞体外成熟培养效果的影响。结果表明: (1)卵母细胞分级培养时,A级(253/324,78.09%)、B级COCs(520/689,75.47%)的COCs体外成熟率明显高于C级COCs(37/137,64.03%)和不分级混合培养(794/1240,27.01%),差异显著(P<0.05)。 (2)以改良TCM199为基础培养液,分别添加10%猪卵泡液(490/1139,43.02%)、10%发情猪血清(599/1426,42.00%)于对照组(改良的TCMl99基础培养液,607/1264,48.02%)相比,体外成熟率差异不显著(P>0.05);两个实验组之间没有明显差异(P>0.05)。 (3)以改良TCM199为基础培养液,分别添加10%发情牛血清(1027/1397,73.51%)、10ng/mlEGF(1040/1368,76.02%)于对照组(607/1264,48.02%)相比,卵母细胞体外成熟率明显提高,差异显著(P<0.05);两个实验组之间没有明显差异(P>0.05)。 实验结果表明,对猪体细胞核移植受体卵母细胞的体外成熟培养,以培养前分级处理和在改良TCM199基础培养液中添加10%发情牛血清或10ng/mlEGF成熟效果较好。 2、猪卵丘细胞核移植研究:以猪卵丘细胞作为供核细胞,用电激活法激活卵母细胞,比较了卵丘细胞获得方法、受体卵母细胞去核方法、重建胚构建方法对猪卵丘细胞核移植效果的影响。结果表明: (1)卵丘细胞获得方法对猪核移植效果影响:本实验获取作为供核细胞的猪卵丘细胞方法有两种。其一,直接从成熟卵母细胞周围分离得到卵丘细胞;其二,卵丘细胞经过体外培养传代4代的卵丘细胞,以重建胚早期发育率为指标,比较了两种供核细胞对猪核移植效果的影响。结果表明:以这两种方法获得的供核细胞形成重建胚的卵裂率(37.76%(37/98)/38.93%(51/131))、4-8细胞率(12.24%(12/98)/12.2105(16/131))及桑椹胚率(2.04%(2/98)/1.53%(2/131))均无显著差异(P>0.05)。因此,直接从成熟卵母细胞周围分离得到卵丘细胞可以作为核供体进行核移植,使操作程序简化。