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研究背景自体脂肪移植（autologous fat grafting,AFG）具有组织来源广泛、无免疫排斥等特点,被广泛应用于整形外科手术中。但是,AFG常受制于脂肪吸收率较高、体积保持率较低等问题。既往研究发现,血运的早期建立有利于移植脂肪的保留,并且脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）及其外泌体可以在AFG中发挥积极作用。另外,胸腺素β4（thymosin β4,Tβ4）已被充分证实与血管生成、抗炎、心脏保护和干细胞迁移、分化等有关。我们课题组在前期的动物实验中首次发现Tβ4可以通过促进血管生成改善移植脂肪的体积保持率,但是Tβ4在其中所发挥的具体作用和机制尚未明了。研究目的1.明确Tβ4对ADSCs生物学特性的影响,并初步探讨其机制;2.探讨Tβ4对内皮细胞（endothelial cells,ECs）生物学特性的影响;3.探讨Tβ4处理的ADSCs所分泌的外泌体可能在AFG中对ECs发挥的作用和机制。研究方法和结果1.探讨Tβ4对ADSCs生物学特性的影响和相关作用机制方法:（1）ADSCs的提取及鉴定:从14例吸脂患者废弃的脂肪组织中提取并获得ADSCs。体外诱导ADSCs向成脂、成骨和成软骨分化,评估其分化能力。流式细胞术鉴定细胞表面的间充质干细胞特异性标志物。（2）Tβ4对ADSCs生物学特性的影响和相关作用机制:CCK-8和流式细胞术分别测定细胞活性和细胞周期,验证ADSCs的增殖能力。流式细胞术测定细胞凋亡,与活/死细胞染色共同验证ADSCs在坏死性凋亡诱导后的抗凋亡能力。划痕实验检测细胞迁移,实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测包括前述细胞表型、促血管新生以及下游通路在内的相关基因表达情况。结果:ADSCs P3代细胞被诱导后可向成脂、成骨和成软骨分化,其表面的CD90、CD105 和 CD73 均呈现阳性表达,而 CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR呈现阴性表达。Tβ4可以促进ADSCs增殖,改善细胞的抗坏死性凋亡能力,提高促血管新生相关基因的表达,诱导ADSCs向内皮分化,同时不会影响细胞的正常凋亡过程,在短期内也不会显著改变ADSCs的迁移能力。另外,Tβ4可能通过Hippo通路调控ADSCs细胞表型的变化。2.探讨Tβ4对ECs生物学特性的影响方法:研究使用的是人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）。CCK-8检测细胞活性,流式细胞术测定细胞周期、细胞凋亡和抗坏死性凋亡能力。Transwell实验检测细胞迁移,qRT-PCR检测包括前述细胞表型和血管新生在内的相关基因表达情况。结果:Tβ4对HUVECs在细胞增殖、抗坏死性凋亡和血管新生等方面均存在积极作用,对细胞的正常凋亡进程没有影响,并且在短期内不会显著改变HUVECs的迁移能力。3.探讨Tβ4处理的ADSCs所分泌的外泌体可能在AFG中对ECs发挥的作用和机制方法:（1）外泌体的提取及鉴定:收集经过Tβ4处理和未经过处理的ADSCs培养上清,使用差速离心法分别提取外泌体。透射电子显微镜观察外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析检测外泌体粒子浓度和粒径分布,蛋白印迹实验验证外泌体表面特异性蛋白。内化实验验证外泌体能否被ECs摄取。（2）分析筛选关键分子和信号通路:二代测序（next-generation sequencing,NGS）技术检测两组不同处理的ADSCs外泌体中微小RNAs（microRNAs,miRNAs）的表达,获取差异表达微小 RNAs（differentially expressed microRNAs,DEMs）。多个 miRNA-mRNA 数据库共同预测 DEMs靶基因。生物信息学分析预测靶基因可能涉及的生物学功能和信号通路,构建蛋白互作网络,预测基因簇和枢纽基因,筛选Tβ4处理的外泌体在AFG中可能对ECs发挥作用所涉及的关键分子和信号通路。结果:使用差速离心法可以得到符合标准的外泌体,两组外泌体均可被ECs摄取。使用NGS技术在外泌体中共识别出2651个miRNAs。以未处理组作为对照,Tβ4处理组中共有179个DEMs,包括80个上调miRNAs和99个下调miRNAs。随后,两组DEMs分别预测得到621种和572种靶基因。结合生物信息学分析和既往相关研究的结果,最终筛选出多个可能涉及细胞增殖、凋亡、炎症、血管新生等生物学特性的分子和信号通路。研究结论1.Tβ4对ADSCs的增殖、抗坏死性凋亡和促血管新生能力具有促进作用,可诱导ADSCs向内皮分化。同时,Tβ4不会影响ADSCs正常的凋亡过程和短期内的迁移能力。另外,Tβ4可能通过Hippo通路对ADSCs的生物学特性进行调控;2.Tβ4可以提高HUVECs的增殖、抗坏死性凋亡和血管新生能力,不会影响细胞的正常凋亡和短期内的迁移能力;3.在脂肪移植中,Tβ4处理ADSCs后产生的外泌体可能通过多个涉及细胞增殖、凋亡、炎症、血管新生等生物学特性的分子和信号通路对ECs发挥作用。