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第一部分 NLS-RARα和RARα重组慢病毒载体的构建及其稳定转染细胞株的筛选目的:本实验构建携带目的基因的重组慢病毒,感染白血病细胞NB4并筛选出稳定转染的细胞株。方法:分别以质粒p CMV-HA-NLS-RARα和p CMV-HA-RARα为模板,PCR扩增NLS-RARα和RARα基因,将其分别亚克隆到能表达绿色荧光蛋白的慢病毒载体质粒LV5中,经限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定重组载体;用4质粒系统共转染293T细胞;荧光显微镜观察293T细胞绿色荧光蛋白的表达情况,收集病毒上清,浓缩,测定重组慢病毒的滴度。重组慢病毒感染NB4细胞,流式细胞术检测感染效率,用嘌呤霉素筛选出分别稳定转染NLS-RARα和RARα的两组细胞株,Western blot检测稳转细胞株中目的基因的表达。结果:重组慢病毒载体质粒经限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实NLS-RARα和RARα分别克隆入穿梭质粒LV5的多克隆位点,荧光显微镜下观察可见293T细胞有大量的绿色荧光,浓缩后重组慢病毒滴度为2×108 Tu/ml。慢病毒对白血病细胞NB4有很高的感染效率,经嘌呤霉素筛选获得了稳定转染目的基因的NB4细胞株。Western blot检测目的基因在稳转细胞株中稳定有效的表达。结论:成功构建LV-NLS-RARα和LV-RARα的重组慢病毒,并且筛选出分别稳定转染NLS-RARα和RARα的NB4细胞株。第二部分 NLS-RARα对白血病细胞NB4增殖和分化的影响及其机制的研究目的:在稳转目的基因的NB4细胞株中,观察NLS-RARα对白血病细胞株增殖和分化的影响及机制。方法:CCK-8法检测NLS-RARα对NB4细胞增殖的影响;用流式细胞术(FCM)检测细胞周期;用维甲酸处理后FCM检测细胞分化相关抗原CD11b;瑞氏染色检测细胞核形态变化;Western blot分别检测NLS-RARα、t-AKT、p-AKT、t-GSK3β、p-GSK3β和c-myc等蛋白的表达情况。结果:CCK-8结果显示NLS-RARα能够明显促进细胞增殖;流式细胞术显示NLS-RARα组细胞S期细胞增多,G2期细胞减少;CD11b表达明显降低,胞核形态变化不明显;Western blot检测NLS-RARα基因在NB4细胞中稳定有效的表达,同时p-AKT、p-GSK3β、c-myc蛋白明显增高,用PI3K抑制剂LY294002处理后p-AKT、p-GSK3β、c-myc明显降低。结论:NLS-RARα可能通过激活PI3K-AKT信号通路,促进NB4细胞的增殖并抑制维甲酸诱导的分化。