神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤。根据组织病理学和临床特点,胶质瘤分为低级别Ⅰ级和Ⅱ级与高级别Ⅲ级和Ⅳ级,并且低级别的胶质瘤将不可避免的向高级别发展。尽管做手术、放疗和化疗等综合性的治疗,高级别胶质瘤患者平均生存期限仍低于一年。最近研究资料表明,脑正常发育过程和肿瘤发生过程具有很多相似性。例如,NF1,一个肿瘤抑癌基因,在正常中枢神经系统发育过程中起着非常重要的作用,其失活参与了胶质瘤的形成。与其相似,Sonic hedgehog-patched信号通路在正常小脑生长过程中起着重要调节作用,同时也是小脑髓母细胞瘤重要的突变靶基因。鉴于以上研究,参与正常发育过程中的基因,如果表达失调,有可能参与肿瘤的发生。胶质瘤是一个典型的研究正常发育与肿瘤发生的模型。尽管众多参与正常发育过程中的基因同时也是形成肿瘤的重要靶基因,但胶质瘤发生的机制仍不清楚。GRIM-19是在研究干扰素β(interferon-p, IFN-p)和全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid, RA)诱导肿瘤细胞凋亡过程中,用反义敲除技术筛选出来的一个新基因。单一RA不能诱导GRIM-19mRNA的表达；单一IFN-p可微弱诱导GRIM-19mRNA的表达,而IFN-β与RA联合应用则可强烈诱导GRIM-19的表达,并导致细胞的凋亡。GRIM-19不属于现已知的任何死亡基因如Bcl-2, caspase和death receptor家族。为进一步研究GRIM-19的生物学功能,我们研究小组将GRIM-19基因敲除,发现GRIM-19·/-敲除小鼠于胚胎9.5天时死亡,表明GRIM-19是胚胎发育过程中一个必不可少的基因。GRIM-19主要位于线粒体,少量存在于细胞核内。总之,GRIM-19在胚胎发育、细胞生长和线粒体等方面起着重要作用。最近一些研究报道,GRIM-19在多种肿瘤组织中如肾癌、甲状腺癌及子宫颈癌表达失调,提示GRIM-19可能在肿瘤细胞生长过程起着重要调节作用。GRIM-19基因定位于人染色体19p13.1-13.2。有报道称,19号染色体的缺失与胶质瘤表型密切相关。但是到目前为止,有关GRIM-19在胶质瘤中的表达及其作用未见报道。本研究中,我们检测GRIM-19在人各级胶质瘤标本和胶质瘤细胞系中的表达。结果显示,GRIM-19在胶质瘤中的mRNA和蛋白表达水平显著低于对照组,并且其表达水平与胶质瘤级别呈负相关。体外研究表明,GRIM-19下调明显促进胶质瘤细胞的增殖和迁移,过表达则呈现相反的作用。我们进一步证实,GRIM-19可调节STAT3的活化及其下游靶基因的表达,提示其在胶质瘤可能通过STAT3信号通路发挥作用。此外,我们证实GRIM-19也可能通过非STAT3途径发挥作用。总之,本研究表明大多数胶质瘤标本中GRIM-19呈现低表达,提示其在胶质瘤发生发展过程中可能起着重要作用。第一部分GRIM-19在胶质瘤中的表达为检测GRIM-19在胶质瘤中的表达,58例被诊断为胶质瘤的临床标本作为研究样本。本实验所使用的胶质瘤标本均经过最后的病理诊断证实,并严格按照世界卫生组织(World Health Organization, WHO)2007年制定的新分级标准进行病理分级。标本中含有16例低级别(Ⅱ级)和42例高级别(Ⅲ和Ⅳ级)的胶质瘤。此外,我们收集5例脑外伤病人的脑组织作为正常对照。我们首先提取胶质瘤及正常对照脑组织的总RNA和总蛋白,通过RT-PCR和Western Blot方法,分别检测GRIM-19在不同级别胶质瘤标本和正常脑组织中mRNA和蛋白的表达水平；利用免疫组织化学技术,观察GRIM-19蛋白在胶质瘤标本和正常脑组织中的表达。RT-PCR结果显示,GRIM-19 mRNA在胶质瘤中的表达水平明显低于正常脑组织,而且GRIM-19的表达水平与胶质瘤恶性程度呈负相关。与之相反,GRIM-19在所有正常对照脑组织中呈现高水平表达。与此一致,Western Blot结果显示,GRIM-19在胶质瘤中的蛋白表达水平明显低于正常对照组。免疫组织化学结果显示,GRIM-19阳性染色主要位于细胞浆中,细胞核内含量较低。正常脑组织中绝大部分细胞呈GRIM-19阳性染色。而胶质瘤标本中的GRIM-19的阳性细胞数显著低于正常脑组织。且随着胶质瘤级别恶性程度的升高,GRIM-19阳性细胞数逐渐减少。以上结果表明,GRIM-19在多数胶质瘤标本呈低水平表达,且表达水平与胶质瘤的恶性程度呈负相关。第二部分GRIM-19对胶质瘤细胞生长和迁移的影响尽管研究表明,GRIM-19在多种肿瘤组织表达失调甚至发生突变,但GRIM-19在肿瘤发生中的作用及作用机制仍不明确。为研究GRIM-19在胶质瘤细胞中的作用,我们利用人U251恶性胶质瘤(malignant glioma, MG)、U87MG和A172细胞系作为体外模型,研究GRIM-19在胶质瘤中的作用。我们首先检测了GRIM-19在以上三个胶质瘤细胞系中的蛋白表达情况。结果显示,U251MG细胞中GRIM-19表达较高,A172细胞中表达适中,而在U87MG细胞中表达相对较低。因此,我们将GRIM-19 knock-down (KD)质粒转染于U251MG细胞,而将GRIM-19表达质粒转染于U87MG细胞内,以检测上调和下调GRIM-19在胶质瘤细胞中的作用。Western blot检测结果表明,转染GRIM-19表达质粒的胶质瘤细胞中的GRIM-19表达水平显著高于对照组。转染GRIM-19-KD质粒的胶质瘤细胞中的GRIM-19表达水平显著低于对照组。以上实验结果表明细胞的转染效率可适用于后续实验。我们分别从细胞活力、增殖和迁移三方面研究GRIM-19在胶质瘤细胞中的作用。首先,我们用MTT检测GRIM-19对胶质瘤细胞活力的影响。结果显示,与对照组相比,降低GRIM-19表达明显促进胶质瘤细胞的生长；相反地,过表达GRIM-19则抑制了胶质瘤细胞的活性。进而,我们采用细胞克隆形成率的方法来评价GRIM-19对胶质瘤细胞长期增殖的影响。结果显示,降低GRIM-19表达明显提高胶质瘤细胞克隆形成率；与之相反,过表达GRIM-19则抑制胶质瘤细胞克隆形成率。以上结果提示,GRIM-19低表达促进了胶质瘤细胞的生长和增殖。胶质瘤细胞除无限的生长增殖外,向正常脑组织浸润、侵袭是它的另一显著特点。通过细胞划痕实验,我们检测了GRIM-19对胶质瘤细胞迁移能力的影响。结果显示,降低GRIM-19促进了胶质瘤细胞的迁移；与此相反,过表达GRIM-19抑制了胶质瘤细胞的迁移。总之,GRIM-19低表达促进胶质瘤细胞的生长、增殖和迁移。鉴于大部分胶质瘤标本中的GRIM-19呈现低表达,提示GRIM-19可能参与了胶质瘤的发生发展过程。第三部分GRIM-19对胶质瘤细胞生长和迁移作用的机制研究我们采用与第二部分相同的胶质瘤细胞模型及同样的GRIM-19调节模式,探讨GRIM-19对胶质瘤细胞生长和迁移的作用机制。众多研究资料显示,STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3,信号转导及转录激活因子3)在生理条件下激活短暂,并且严格受负反馈的调节。然而STAT3在许多肿瘤包括胶质瘤中呈持续性激活状态,其下游靶基因持续作用于瘤细胞,促进肿瘤的生长、迁移及血管形成等生物学作用。STAT3的活化位点主要在705位酪氨酸残基(Tyr705)的磷酸化。本研究结果显示,胶质瘤标本中STAT3呈持续性活化状态,而且活化的阳性细胞数与胶质瘤的级别呈正相关,提示STAT3表达失调在胶质瘤的发生发展中可能起着重要作用。我们与其他研究组以前证实GRIM-19和STAT3是一对相互作用的蛋白,因此推测GRIM-19对胶质瘤的影响可能是通过STAT3信号通路发挥作用。首先,我们检测GRIM-19对胶质瘤细胞系中STAT3活化(磷酸化)的影响。结果显示,过表达GRIM-19抑制了STAT3-Tyr705的磷酸化；相反,降低GRIM-19促进了STAT3-Tyr705的磷酸化,但在以上两种情况下,GRIM-19对STAT3总蛋白的表达没有显著的影响。同时,我们应用细胞核浆分离实验,证实GRIM-19阻止了STAT3的核移位。我们进一步检测GRIM-19对STAT3下游靶基因的影响。结果表明,下调GRIM-19促进了STAT3许多下游靶基因包括Survivin, CyclinDl, BCl-XL, Bcl-2, Hifl-α和MMP-9的表达,上调GRIM-19出现相反的效应。此结果提示,GRIM-19对胶质瘤细胞的影响至少一部分通过STAT3信号通路发挥作用。此外,我们推测GRIM-19对胶质瘤细胞的影响也可能通过非STAT3信号通路发挥作用。因此,我们检测GRIM-19对两个STAT3非依赖的、与胶质瘤发生密切相关的两个基因GADD153和COX-2的调节作用。结果显示,GRIM-19表达下调抑制GADD153表达和促进COX-2的表达,而过表达GRIM-19则出现相反的效果。总之,我们首次揭示了GRIM-19在胶质瘤中的低表达,并且GRIM-19抑制胶质瘤细胞的生长和迁移。进而,我们也证实了GRIM-19在胶质瘤中可能通过依赖STAT3和非STAT3信号通路发挥作用。鉴于GRIM-19在胶质瘤中的作用,恢复GRIM-19或许是治疗胶质瘤的一个新靶点。