背景：基因治疗是指通过一定的方法将外源DNA分子导入病人体细胞并有效表达，从而纠正缺陷性状和表型，达到治疗疾病的目的。目前应用于基因治疗的的载体主要包括病毒载体和非病毒载体两大类.病毒载体和非病毒载体都具有各自的优势，被广泛的应用。病毒载体相对于非病毒载体具有高效的特点。但是病毒载体具有免疫原性和随机整合等安全性问题，因此非病毒载体相对来说具有独特的安全性优势。本实验室所开发研究的“人源基因载体pHrneo”是一种非病毒载体，前期的临床前研究证实其可能是一种应用于基因治疗的有效的打靶载体，但其打靶效率仍有待进一步提高。锌指酶是一种人工嵌合酶，它能够通过在基因组的特定位点制造DNA双链断裂刺激细胞内同源重组，使打靶效率提高5000倍以上，它可能是一种提高人源基因打靶载体打靶效率的有效的工具。 目的：建立体外快速设计鉴定有效锌指酶的系统；设计鉴定出能有效切割位于h rDNA区的打靶位点的锌指酶，为进一步应用于提高人源基因载体打靶效率打下基础。 方法：1、本研究选择了3个打靶位点，根据相关文献数据，设计了4组锌指酶(8个锌指酶单体)；2、利用OVER-LAP PER的方法合成锌指酶基因，并构建相应的表达载体；3、通过TNT-T7快速转录翻译试剂盒快速翻译锌指酶蛋白，通过与含有靶向位点的DNA质粒载体作用，应用体外两步法进行锌指酶有效性鉴定；4、将所设计的锌指酶表达载体与phr-GFP转染HEK293-T及HL7702细胞，观察荧光表达效率以及细胞毒性。 结果：1、通过体外快速鉴定，所设计的8个锌指酶同源二聚体中，5个能够有效地作用于靶位点；4组锌指酶异源二聚体中，针对3号位点的一组在异源二聚体水平有效。2、体外鉴定有效的锌指酶表达载体未能促进基因打靶效率，也未表现出明显的细胞毒性。 结论：体外快速两步法能够作为一种有效的方法在体外筛选有效的锌指酶；ZFN-S3L/ZFN-S3R二聚体在体外有效，但其在应用于细胞前还需要进行优化。