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卵激活与雄原核重建是有性生殖胚胎正常发育缺一不可的必要前提条件。精子因子诱发卵子发生胞内Ca2+释放是动物卵激活的必需条件;精子只有重建为有功能的雄原核,才能进行下一步发育。
本论文利用非洲爪蟾(Xenopuslaevis)成熟卵子建立了卵无细胞体系,首先用该体系研究了精子因子触发胞内Ca2+释放的可能机制。结果显示,1)IP3能诱导爪蟾卵无细胞体系释放Ca2+,爪蟾精子抽提物能诱导爪蟾卵无细胞体系的Ca2+显著升高;2)牛精子抽提物未能诱导出明显的钙峰,但能显著增强IP3诱导的钙峰。这些结果表明:精子因子可能通过致敏IP3受体的机制来诱导胞内Ca2+释放。
第二,利用爪蟾卵无细胞体系,研究了雄原核重建过程及参与重建的相关因子。研究结果显示:爪蟾卵无细胞体系支持精核去致密,小鼠精子能在抽提物中形成球形核结构。热处理的爪蟾卵低速抽提物及其超速离心上清具有相同反应活性。胞外这种去致密作用不受Ca2+信号通路的调控,小鼠精子的去致密只能在一个狭窄的pH范围内进行。在热处理爪蟾卵抽提物中加入ATP,热处理爪蟾卵抽提物对精子的去致密活性下降。放射自显影结果显示,热处理爪蟾卵抽提物中有两个大分子(~200kD)蛋白被磷酸化。用2D电泳和液相层析方法纯化了这两个蛋白,质谱的测序结果表明其中一条与MAPs家族的MAP4有同源序列,我们暂将其命名为MAP5,另一条是铁蛋白新类型。免疫结果表明MAP5是卵特异蛋白,并且在细胞核内有富集现。对爪蟾卵的组织定位表明,MAP5在1,2期卵母细胞中含量很低,在3,4期卵母细胞卵主要分布在细胞核,5,6期卵母细胞卵MAP5分布在细胞核,但动物极也开始有信号,在MⅡ期分布于动物极靠近细胞膜一小片区域。小鼠卵的免疫结果显示:MAP5在卵细胞质与细胞核均有分布,但在细胞核区有富集,在MⅡ期分布在纺锤体上。用MAP5的抗血清与热处理爪蟾卵抽提物孵育后,再与去膜小鼠精子一起孵育,结果显示去膜小鼠精子的重建速度变慢。这些结果表明:MAP5是一个卵巢特异蛋白,在卵细胞发育过程重表达表现出与发育时期特异性及明显的细胞内定位变化模式,可能影响去膜精子核重建的速度。MAP5的确切生物学功能尚待深入揭示。