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一、目的通过研究不同剂量氯氮平单用或者与氟伏沙明合用对C57BL/6雄性小鼠代谢的影响,探讨氯氮平影响血糖的机制。二、方法1.氯氮平单用或与氟伏沙明合用对C57BL/6雄性小鼠血糖和血脂的影响120只雄性C57BL/6小鼠随机分成6组:（1）空白对照组;（2）氯氮平2 mg/kg组;（3）氯氮平10 mg/kg组;（4）氟伏沙明2 mg/kg组;（5）氯氮平2 mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组;（6）氯氮平10 mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组;上述各组小鼠连续28 d早晨8∶30腹腔注射给予相应药物,在给药前称小鼠的体重和测定空腹血糖（FBS）,并于给药后7 d、14 d、21 d、28 d称小鼠体重。在试验的第29 d断尾取血测定每只小鼠FBS、糖耐量（给小鼠腹腔注射25%的葡萄糖2 g/kg,测定给葡萄糖后30 min、60 min、120 min血糖）,再用戊巴比妥钠（130 mg/kg）麻醉小鼠,然后摘除小鼠眼球,取0.6 mL眼眶血置于肝素抗凝管中。每组小鼠中10个血样用于测定胰岛素和血脂水平【包括甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-CH）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-CH）】。2.氟伏沙明对小鼠体内氯氮平及其代谢物血浓度的影响测定上述试验中第（2）氯氮平2 mg/kg组、（3）氯氮平10 mg/kg组、（5）氯氮平2 mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组、（6）氯氮平10mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组各组中另外10只小鼠血浆中的氯氮平、去甲氯氮平和N-氧化氯氮平血药浓度。并将小鼠的血药浓度与空腹血糖、血脂进行相关性分析。首先建立HPLC-MS/MS同时测定氯氮平、去甲氯氮平和N-氮氧化氯氮平血药浓度的方法,采用色谱柱为Waters XteraTMMS C18柱（150 min×3.9 mm,粒径5μm）,柱温40℃,流动相:乙腈—水（36∶64,含10 mmol/L醋酸铵与0.01%甲酸,pH=5.96）,流速:1.0 mL/min。质谱检测采用Waters ZQ二极质谱仪,选用ESI+,扫描方式为选择离子（SIR）检测。样品用氮气吹干后再用流动相溶解,进样量20μL。3.氯氮平影响小鼠血糖的机制研究把摘除眼球取血后的小鼠颈椎脱臼处死,取小鼠胰腺和股四头肌。小鼠胰腺置于10%中性福尔马林溶液中固定,常规石蜡包埋,制作石蜡切片（2份）,厚度约4μm。小鼠股四头肌置于液氮中速冻,再转移到-70℃冰箱保存至测定。（1）采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）测定6组小鼠股四头肌中葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）mRNA的表达。（2）一份胰腺石蜡切片常规脱蜡行苏木精-伊红染色,光镜下观察6组小鼠胰腺胰岛淋巴细胞浸润情况。（3）另一份石蜡切片用TUNEL原位末端标记法标记凋亡的β细胞,用SABC免疫组化法标记β细胞,进行β细胞凋亡计数。（4）GLUT mRNA表达量、胰岛淋巴细胞浸润程度、β细胞凋亡率与小鼠的空腹血糖、血脂、氯氮平及其代谢物血药浓度进行相关性分析。三、结果1.氯氮平单用或与氟伏沙明合用对C57BL/6雄性小鼠血糖和血脂的影响试验前各个试验组的体重和空腹血糖（FBS）统计学上没有显著性差异（P＞0.05）;与空白对照组相比,在给药后第14 d、21 d和28d 2 mg/kg氯氮平组小鼠的体重降低,但统计学上没有显著性差异（P＞0.05）;而10 mg/kg氯氮平组小鼠的体重降低,统计学上有显著性差异（P＜0.05）。与空白对照组相比,氯氮平2 mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组小鼠的体重统计学上没有显著性差异（P＞0.05）;而氯氮平10 mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组小鼠在给药后第21 d、28d的体重降低,统计学上有显著性差异（P＜0.05）。与氯氮平单用组相比,氟伏沙明与氯氮平合用组小鼠的体重统计学上没有显著性差异（P＞0.05）。与空白对照组相比,空腹血糖（FBG）、葡萄糖耐量（IGR）、胰岛素水平和胰岛素耐受指数（IRI）只在10 mg/kg氯氮平单用组升高（P＜0.05）;此外,高密度脂蛋白水平（HDL-C）只在10mg/kg氯氮平单用组降低（P＜0.05）。2.氟伏沙明对小鼠体内氯氮平及其代谢物血浓度的影响氟伏沙明对小鼠氯氮平的代谢有抑制作用,与氯氮平2 mg/kg单用组相比,氯氮平2 mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组血中氯氮平、去甲基氯氮平、N-氧化氯氮平浓度统计学上有显著性差异（P＜0.05）,单用组与两药合用组浓度分别为97.61±10.62 ng/mL,176.97±13.61ng/mL（氯氮平浓度）;72.17±10.11 ng/mL,20.35±2.71 ng/mL（去甲基氯氮平浓度）;8.42±1.88 ng/mL,14.89±3.21 ng/mL（N-氧化氯氮平浓度）。与氯氮平10 mg/kg单用组相比,氯氮平10 mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组的氯氮平、去甲基氯氮平、N-氧化氯氮平血药浓度统计学上有显著性差异（P＜0.05）,单用组与两药合用组药物浓度分别为325.07±43.49 ng/mL,727.30±73.34 ng/mL（氯氮平浓度）;112.77±14.00 ng/mL,23.99±6.25 ng/mL（去甲基氯氮平浓度）;31.74±6.37 ng/mL,39.32±7.16 ng/mL（N-氧化氯氮平浓度）。SPSS软件进行相关性分析,氯氮平、去甲氯氮平和N-氧化氯氮平血药浓度与小鼠的空腹血糖（FBS）、血脂统计学上没有相关性（P＞0.05）,但是小鼠的FBS值有随去甲氯氮平浓度增加而增加的趋势。3.氯氮平影响小鼠血糖的机制研究（1）空白对照组小鼠股四头肌中GLUT4 mRNA含量与内参β-actin mRNA表达量之比值为1.02±0.21,氯氮平2 mg/kg组、氯氮平10 mg/kg组、氟伏沙明2 mg/kg组、氯氮平2 mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组、氯氮平10 mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组小鼠股四头肌中GLUT4 mRNA含量与内参β-actin mRNA表达量之比值分别为:0.81±0.20、0.79±0.18、0.95±0.09、0.98±0.06和1.01±0.18。在GLUT4 mRNA与β-actin mRNA表达量之比值方面,与空白对照组相比,氯氮平2 mg/kg组和氯氮平10 mg/kg组统计学上有显著性差异（P＜0.05）,氟伏沙明2 mg/kg组与空白对照组相比统计学上没有显著性差异（P＞0.05）;氯氮平2 mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组和氯氮平10 mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组分别比氯氮平2 mg/kg组和氯氮平10 mg/kg组的比值高,但是只有氯氮平2 mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组和氯氮平2 mg/kg组之间统计学上有显著性差异（P＜0.05）。（2）高倍光学显微镜下观察HE切片,空白对照组、氯氮平2 mg/kg组、氟伏沙明2 mg/kg组、氯氮平2 mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组、氯氮平10 mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组小鼠的胰岛均位于胰腺外分泌部之中,其岛型丰满、轮廓清晰、胰岛细胞均匀分布,均未见淋巴细胞浸润;尽管氯氮平10 mg/kg组小鼠胰岛位于胰腺外分泌部之中,其岛型丰满、轮廓清晰、胰岛细胞均匀分布,未见淋巴细胞浸润,但是该组有2只小鼠的胰岛周围有淋巴细胞浸润,但胰岛内无淋巴细胞浸润。（3）空白对照组、氯氮平2 mg/kg组、氯氮平10 mg/kg组、氟伏沙明2 mg/kg组、氯氮平2 mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组、氯氮平10 mg/kg+氟伏沙明2 mg/kg组胰岛细胞分布均匀,β细胞胞浆呈棕黄色胰岛素阳性表达,未见β细胞凋亡。（4）小鼠GLUT4 mRNA相对表达量与小鼠空腹血糖、去甲氯氮平血药浓度的值呈负相关（P＜0.05,r=-0.814,r=-0.940）,小鼠GLUT4mRNA相对表达量与小鼠的血脂、氯氮平、N-氧化氯氮平血药浓度的值不相关（P＞0.05,r=0.347～0.555）。四结论连续28 d给雄性C57BL/6小鼠腹腔注射10 mg/kg氯氮平,可以降低小鼠体重及高密度脂蛋白水平（HDL-C）,升高小鼠空腹血糖、糖耐量及胰岛素水平。研究发现:单独给予2 mg/kg氟伏沙明治疗没有上述作用,氟伏沙明（2 mg/kg）联合10 mg/kg氯氮平治疗可以改善10 mg/kg氯氮平对血糖、血脂的不良影响。此结果为临床上氯氮平和氟伏沙明联合使用提供理论依据。氟伏沙明与氯氮平联合使用可以抑制氯氮平的代谢,使去甲氯氮平的血浓度明显降低。研究发现:小鼠的空腹血糖与去甲氯氮平的浓度没有显著性相关,但有随氯氮平血药浓度升高而升高的趋势。这提示:氟伏沙明可以降低小鼠血浆中去甲氯氮平的血浓度,这可能是其与氯氮平联合使用可以改善氯氮平对血糖的升高作用的重要机制之一。此结果为临床上使用氯氮平患者出现血糖升高的个体差异性提供理论依据。2 mg/kg氯氮平和10 mg/kg氯氮平可以降低小鼠股四头中GLUT4 mRNA的表达。研究发现:氟伏沙明（2 mg/kg）与氯氮平联合使用可以改善氯氮平对GLUT4 mRNA表达的抑制作用;在小鼠体内GLUT4 mRNA相对表达量与空腹血糖、去甲氯氮平血药浓度的值呈负相关。氟伏沙明、不同剂量的氯氮平对胰腺β细胞的凋亡没有影响,说明氟伏沙明、氯氮平对胰腺β细胞没有明显的毒性作用。上述结果部分阐明了氯氮平升高血糖的机制。