铁皮石斛多糖的提取、分离纯化、结构及生物活性研究

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铁皮石斛是我国传统名贵的中药材,具有极高的药用价值,而多糖是铁皮石斛中最主要的活性成分。本文以铁皮石斛为材料,对铁皮石斛多糖进行提取,并且分离纯化得到了均一组分的多糖DCP1,对其单糖组成、红外光谱结构进行初步研究;并进行了体内、外抗氧化实验,研究DCP1的抗氧化活性;进行体内、外抗肿瘤实验,研究DCP1的抗肿瘤活性,并初步研究其作用机制。论文研究旨在为铁皮石斛多糖的功能性研究、铁皮石斛的开发利用提供一定的理论基础,主要研究内容和结果如下:(1)通过对三种不同提取方法的对比,优选出复合酶法来提取铁皮石斛多糖。提取所得的粗多糖脱蛋白,去除小分子杂质后经DEAE-52纤维素柱层析初步纯化脱色,依次用去离子水、不同浓度的NaCl洗脱,其中以去离子水洗脱效果最好,洗脱得到多糖的含量最高,0.1mol/mLNaCl溶液,出峰面积小,含糖量低,所占的比例太小,故实验中收集以去离子水5-11管洗脱的组分,浓缩、冷冻干燥得铁皮石斛多糖DC-1。将多糖DC-1再复溶,进一步用Sephadex G-100柱分离纯化,得到纯度较高的均一性多糖DCP1。(2)采用HPLC测定DCP1单糖组成,傅里叶红外光谱法分析其结构特征。高效液相分析结果表明DCP1由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖组成,其摩尔比为:1.748:0.973:1.241:1.017:0.561;通过红外光谱图分析,确证了DCP1的糖类特征,说明DCP1是含p-D-甘露吡喃糖苷的中性糖。(3)对多糖DCP1分别测定了还原力、DPPH、ABTS自由基清除率三个体系中的抗氧化作用,结果显示DCP1具有一定的体外抗氧化作用,并呈现出量效关系,但效果不及Vc。(4)采用D-半乳糖衰老的小鼠模型来研究DCP1的体内抗氧化活性,通过测定血清及肝脏中总超氧化物歧化酶(T-SOD)舌力、过氧化氢酶(CAT)活力、丙二醛(MDA)含量。结果表明,DCP1治疗组小鼠的血清和肝脏T-SOD、CAT活力均高于衰老模型组、与正常组相比有所降低;MDA含量与衰老模型组相比均有明显下降,并呈现出量效关系,说明DCP1具有体内抗氧化活性,可增强机体抗氧化系统功能。(5)体外培养人肝癌HepG-2细胞、小鼠肝癌H22细胞,采用MTT法分别测定DCP1它们的抑制作用,结果表明DCP1对人肝癌HepG-2细胞、小鼠肝癌H22细胞有较好地抑制作用,在0-640um/mL浓度范围呈明显的剂量关系,36-48h抑制率增加不明显;对人肝癌HepG-2细胞处理作用48h后,采用AO/EB染色观察细胞形态AO/EB染色,结果显示多糖DCP1可诱导人肝癌HepG-2细胞形态结构发生一系列凋亡特征,提示DCP1对人肝癌HepG-2细胞的抑制作用可能是通过诱导促进细胞凋亡的途径来实现。(6)构建小鼠肝癌H22实体瘤和腹水瘤小鼠模型,研究DCP1体内抗肿瘤作用,通过测定脾脏和胸腺指数,反映其对免疫器官的影响,并测定小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量变化,采用HE染色观察肿瘤组织病理形态变化。实验结果表明,DCP1对小鼠肝癌H22实体瘤有很好的抑制作用,对肿瘤小鼠无明显的毒副作用;DCP1治疗组与生理盐水组相比可提高小鼠免疫器官指数,血清中的IL-2、TNF-α分泌均有一定程度的增加;实体瘤组织呈现凋亡病理学特征;DCP1给药治疗组H22腹水瘤小鼠的生存时间延长。表明DCP1可通过诱导H22肿瘤细胞凋亡和增强肿瘤小鼠免疫力从而达到抑制肿瘤增殖的目的。
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