克氏原螯虾过敏原的性质研究

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近年来,随着克氏原螯虾年产量及消费量的快速增长,因食用克氏原螯虾而导致过敏的病例时有发生,影响着克氏原螯虾的食用安全性及国民的身体健康。因此,开展克氏原螯虾过敏原的研究显得迫切而有意义。本文以克氏原螯虾为研究对象,分析其过敏组分,重点完成过敏原的分离纯化及性质分析,探讨加工处理方法对过敏原致敏性的影响,为开发低致敏性或无致敏性的产品提供重要理论依据。利用27份甲壳类过敏患者血清,通过Western-blotting技术,检测出克氏原螯虾肌肉中40kDa、22kDa及36kDa的蛋白为其过敏组分。采用硫酸铵盐析、离子交换柱层析的方法从克氏原螯虾肌浆中分离纯化出40kDa的的过敏组分,并应用兔抗拟穴青蟹AK多克隆抗体鉴定其为精氨酸激酶(arginine kinase,AK)。其性质研究结果显示,AK是糖含量为0.60%的糖蛋白;对热不稳定,高温处理可以降低其IgE结合活性;对酸不稳定,强碱对其IgE结合活性有一定的影响;AK对胰液具有耐受性;AK具有复杂的空间结构,同时存在线性抗原表位和构象抗原表位。此外,蒸煮处理能有效降低其IgE结合活性。采用硫酸铵盐析、柱层析的方法从克氏原螯虾肌浆中分离纯化出22kDa的过敏组分,并通过MALDI MS鉴定其为肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein,SCP);其性质研究结果表明,SCP是一种糖含量为4.90%的糖蛋白;对热稳定,在强酸碱条件下均不被降解,其热处理及酸碱处理产物的IgE结合活性并没有降低;能被消化酶所降解;SCP具有多态性, SCP-II的IgE结合活性较弱,SCP含有a、b、c三种亚基,均有IgE结合活性;SCP含有较多的转角及卷曲结构,易于形成抗原表位。采用制备丙酮粉、等电点沉淀、硫酸铵盐析、柱层析等方法从克氏原螯虾肌原纤维中分离纯化出36kDa的过敏组分,并应用兔抗拟穴青蟹TM多克隆抗体鉴定其为原肌球蛋白(tropomyosin,TM)。其性质研究结果显示,TM的糖含量为1.14%,对热稳定;对酸碱具有耐受性;能被消化酶所降解;TM是由α-螺旋构成的简单的超螺旋结构,以线性表位居多。肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)和血蓝蛋白(hemocyanin,HMC)是虾类的新型过敏原。本文先对其进行分离纯化,再利用9份甲壳类过敏患者血清进行确认。采用制备丙酮粉、等电点沉淀、硫酸分级盐析及柱层析方法从克氏原螯虾肌原纤维中分离纯化出18kDa的MLC,并通过MALDI MS进行鉴定。利用甲壳类过敏患者血清检测,初步判断MLC为克氏原螯虾的过敏原。其性质研究结果显示,MLC的糖含量为4.30%;对热稳定;在强酸碱性条件下均不被降解;但能被消化酶所降解。MLC主要由α-螺旋和卷曲组成,含有很少的β-折叠和转角,且同时具有线性抗原表位和构象抗原表位。采用离心及凝胶柱层析的方法从克氏原螯虾血淋巴中分离纯化出HMC,并应用兔抗凡纳滨对虾HMC多克隆抗体进行鉴定,结果表明,HMC是由68、72、76、82、84和88kDa六个亚基组成的六聚体。利用甲壳类过敏患者血清检测,初步判断HMC为克氏原螯虾的一种过敏原。其性质分析结果显示,HMC的糖含量为1.99%;对热稳定;对酸不稳定;对胰液耐受性。TM、MLC及SCP具有相似的理化性质,都是热稳定性蛋白,对酸碱稳定,都能被消化酶消化;AK和HMC二者的理化性质较为相近,均对酸不稳定,能耐胰液消化。AK、SCP、MLC空间结构比TM复杂。通过血清学实验、性质分析结果表明TM是克氏原螯虾的主要过敏原,AK、SCP是克氏原螯虾的重要过敏原,初步推断MLC和HMC是克氏原螯虾的潜在过敏原,但克氏原螯虾中可能还存在其他的过敏组分。
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