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本研究旨在通过体外和半体内试验研究LPS对泌乳奶牛乳蛋白和乳脂肪的影响及其机理。在半体内试验,通过阴外动脉灌注LPS,研究其对泌乳奶牛血液中脂肪酸组成、氨基酸组成以及生理生化指标的影响;在体外试验,以乳腺上皮细胞为模型,研究LPS影响脂肪酸和氨基酸代谢的机理。试验一、研究阴外动脉灌注LPS对泌乳奶牛动脉血液中脂肪酸组成、摄取、血液脂质指标及乳脂成分、乳脂合成前体物和乳脂脂肪酸组成的影响。选用6头泌乳中后期(185.67±30.11 d DIM)、体重相近(576.33±36.67 kg)的经产荷斯坦奶牛,随机分成2组。采用交叉试验设计,每期试验7 d,间隔期14 d;试验组阴外动脉灌注LPS(Escherichia coli O111: B4,0.01μg/kg体重),对照组阴外动脉灌注生理盐水。结果显示:阴外动脉灌注LPS未显著影响动脉血浆中脂肪酸的组成(P>0.05),但有增加血浆中TFA量、SFA含量、SLFA含量和CLFA含量的趋势。与对照组相比,LPS组不同程度的提高了乳腺对碳链长度大于16的脂肪酸摄取率,除对C20的摄取率达到极显著水平(P<0.01)外,对其余脂肪酸的摄取率影响差异不显著(P>0.05)。与对照组相比,动脉血浆中CHOL含量显著提高(P<0.05),HDLD含量和LDLD含量有提高的趋势(P>0.05)。阴外动脉灌注LPS降低了生鲜乳中乳脂率(P>0.05)和乳脂肪产量(P>0.05)。与对照组相比,LPS组血浆中乳脂合成前体物NEFA含量极显著降低(P<0.01),BHA含量呈先降低后升高的趋势(P>0.05)。LPS不同程度地降低了乳脂中饱和脂肪酸(P>0.05)和短链脂肪酸(P>0.05)的含量,提高了乳脂中不饱和脂肪酸(P>0.05)和中长链脂肪酸(P>0.05)的含量,并影响脂肪酸的去饱和作用。结果表明,LPS能动员机体的脂类代谢,以抵抗LPS对动物机体诱发的炎症反应,LPS是诱发乳脂发生变化的主要激发因子之一。试验二、研究阴外动脉灌注LPS对泌乳奶牛血液中氨基酸组成和乳蛋白中氨基酸组成以及血液理化指标的影响。结果显示,LPS显著提高了乳蛋白率(P<0.05),酪蛋白含量有提高的趋势,但影响差异不显著(P>0.05)。与对照组相比,乳蛋白产量和酪蛋白产量都有不同程度的降低,但影响差异不显著(P>0.05)。生鲜乳中EAA、BCAA含量随着灌注时间的延续呈现先升高后降低的趋势(P>0.05),在灌注后6 h达到最高;生鲜乳中NEAA含量随着灌注时间的延续呈现先降低后升高的趋势(P>0.05),在灌注后6 h达到最低。与对照组相比,阴外动脉灌注脂多糖对动脉血浆中氨基酸组成没有显著影响(P>0.05),但有提高血浆中his和met含量(P>0.05)的趋势,ser、glu、gly、arg、thr、ala、pro、cys、val、lys、iie、leu和phe含量有不同程度的降低(P>0.05)。阴外动脉灌注脂多糖降低了泌乳奶牛动脉血液中GH含量(P>0.05)、BUN含量(P>0.05)、GLB含量(P>0.05)和TBIL含量(P>0.05),提高了动脉血清中胰岛素含量(P>0.05)、GLU含量(P>0.05)和ALB含量(P>0.05)。血浆中葡萄糖含量随着灌注时间呈现先升高后降低的趋势,灌注后12 h达到最高(P>0.05)。与对照组相比,阴外动脉灌注脂多糖极显著提高了动脉血液中ALT活性(P<0.01)、AST活性(P<0.01)和ALP活性(P<0.01),LD活性有所提高,但影响差异不显著(P>0.05)。结果表明,脂多糖动员机体氨基酸用于急性期反应蛋白合成的过程中,干扰了生鲜乳中乳蛋白合成所需氨基酸的量和组成。试验三、研究阴外动脉灌注脂多糖对泌乳奶牛动脉血浆和生鲜乳中蛋白变化的影响,以揭示脂多糖刺激机体应答的分子机制。泌乳奶牛经阴外动脉注射LPS(0.01μg?kg -1体重)后分别在不同时间点采集奶样和血样,采用双向电泳与质谱相结合的方法,双向电泳技术分离蛋白,考马斯亮蓝G-250染色后用PDQuest 8.0.1软件自动检测差异蛋白斑点,并经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定。结果显示:LPS极显著影响乳汁中的体细胞指数(P<0.01),在灌注后6 h体细胞指数达到最高,此后逐渐下降,24 h恢复到注射前水平。0、6、12和24 h血浆蛋白凝胶图谱分析后发现,8个蛋白点在6、12和24 h表达量升高,质谱鉴定为4种蛋白质(VD-结合蛋白前体、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3-6、α1-抗胰蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂A3-1前体)。这些蛋白在LPS注射后6、12和24 h表达量显著高于0 h,但它们在6-24 h之间的表达量无显著差异。0、6、12、24 h脱脂乳凝胶图谱分析后发现,3个蛋白点在12 h表达量升高,质谱鉴定为2种蛋白(β-乳球蛋白和α-延伸因子1)。0、6、12、24 h乳清蛋白凝胶图谱没有明显的变化。结果表明,VD-结合蛋白前体、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3-6、α1-抗胰蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂A3-1前体可能在奶牛机体对LPS刺激应答中具有重要作用,其作用机制还有待进一步研究。试验四、以泌乳奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究脂多糖对泌乳奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸代谢通路中关键酶和转录因子基因转录表达的影响。基础培养基中LPS添加浓度分别为0 ng.mL-1、0.1 ng.mL-1和10 ng.mL-1,培养24 h后,采用RT-qPCR检测目的基因的相对表达水平。结果显示,LPS对乳腺上皮细胞中脂肪酸结合蛋白FABP3和FABP4影响差异不显著(P>0.05),与对照组相比,LPS极显著提高了奶牛乳腺上皮细胞中脂肪酸转运蛋白CD36的基因表达丰度(P<0.01),并且具有剂量效应。与对照组相比,低剂量(0.1 ng.mL-1)LPS有提高脂肪酸合成酶FASN、ACACA、ACSS2和脂肪酸调控网络中PPARG与PPARGC1A基因表达丰度的趋势(P>0.05),高剂量(10 ng.mL-1)LPS抑制了脂肪酸合成酶FASN、ACACA、ACSS2和脂肪酸调控网络中PPARG与PPARGC1A基因表达水平(P>0.05)。结果表明,LPS干扰脂肪酸代谢,低剂量(0.1 ng.mL-1)LPS动员脂肪酸的代谢,高剂量(10 ng.mL-1)LPS抑制脂肪酸的合成,但尚待在蛋白水平进一步证实。试验五、以泌乳奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究LPS对泌乳奶牛乳腺上皮细胞mTOR通路和JAK2/STAT5路径相关基因表达的影响。基础培养基中LPS添加浓度分别为0 ng.mL-1、0.1 ng.mL-1和10 ng.mL-1,培养24 h后,采用RT-qPCR检测目的基因的相对表达水平。结果显示,LPS提高了S6K1和4EBP1 mRNA的表达水平(P>0.05),并且具有剂量效应。mTOR mRNA的基因表达水平受LPS影响差异不显著(P>0.05)。LPS对JAK2 mRNA的表达水平影响不显著(P>0.05),但有提高的趋势。与对照组相比,LPS显著提高了STAT5 mRNA表达转录水平(P<0.05)。结果表明,LPS影响乳腺上皮细胞中蛋白合成通路mTOR相关基因的转录表达,并且具有剂量依赖效应;LPS提高了乳腺上皮细胞中JAK2/STAT5路径中相关基因的转录表达。总体结论:①当泌乳奶牛阴外动脉灌注LPS剂量为0.01μg/kg BW时,泌乳奶牛机体内脂类代谢增强,脂解作用增加,以抵抗LPS应激诱发的炎症反应;同时,降低乳腺内SCFA的合成,提高乳腺对MCFA和LCFA的摄取,但总体降低了乳脂率和乳脂肪产量;其机制是LPS影响了乳腺内脂肪酸的摄取、活化与转运等关键合成和调控基因;总体来说,LPS是诱发泌乳奶牛乳脂发生变化的主要激发因子之一。②当泌乳奶牛阴外动脉灌注LPS剂量为0.01μg /kg BW时,LPS动员机体氨基酸用于急性期反应蛋白合成的过程中,干扰了生鲜乳中乳蛋白合成所需氨基酸的量及其组成;其具体机制是LPS影响蛋白合成通路mTOR和JAK2/STAT5路径。