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目的:研究5.5EG(Ethylene Glycol,乙烯乙二醇)玻璃化冷冻卵巢组织的最佳预处理时间,比较5.5EG在不同的预处理时间下卵巢组织中卵母细胞的存活率以及卵巢组织的DNA的变化;比较玻璃化冷冻卵巢组织的最佳冷冻保护剂配方,比较卵巢组织经EG5.5、EG+二甲基亚砜(Dimethylsuphoxide,DMSO)和EG+甘油(Glycerol,GC)三种玻璃化冷冻溶液冻融后卵母细胞的存活率;观察卵巢组织中始基卵泡超微结构的变化;研究经EG+DMSO玻璃化冻融的卵巢组织分离的GV期卵母细胞体外培养成熟后细胞骨架的变化,比较它与新鲜的MⅡ期卵母细胞的纺锤体正常率。探讨玻璃化冷冻的方法及其冻存小鼠卵巢组织的可行性。方法:1.卵巢组织分别以5min、10min和15min暴露于1.5M EG磷酸盐缓冲液中,经两步脱水后直接投入液氮。玻璃化冻融的卵巢组织以新鲜卵巢组织为对照,观察各组卵巢组织HE染色切片,比较各组之间卵泡的完整率;提取各组卵巢组织DNA进行琼脂糖凝胶电泳,比较各组DNA变化的情况。2.卵巢组织经EG5.5、EG+ DMSO(DMSO组)和EG+甘油(GC组)三种玻璃化冷冻溶液冻存,分离复苏后的卵巢组织,使用碘化丙啶(PI)染色,比较各组卵母细胞的存活情况。3.应用透射电子显微镜观察玻璃化冻融的卵巢组织中始基卵泡超微结构的变化;研究玻璃化冻融的卵巢组织分离的GV期卵母细胞体外培养成熟后细胞骨架的变化,比较它与新鲜的MⅡ期卵母细胞的纺锤体正常率。结果:1.卵巢组织分别以5min、10min和15min暴露于1.5M EG磷酸盐缓冲液,玻璃化冻融的卵巢组织HE染色切片的形态完整卵泡率分别为11.90%、31.82%和17.39%,实验组Ⅰ(预处理5min)与对照组(34.78%)相比差异具有显著性意义(P<0.05),实验组Ⅱ(预处理10min)和Ⅲ(预处理15min)与对照组相比差异没有显著性意义(P>0.05);各组冻融的卵巢组织提取DNA,与对照组相比,DNA琼脂糖凝胶电泳的结果没有明显差别。2.卵巢组织经EG5.5、EG+ DMSO(DMSO组)和EG+甘油(GC组)三种玻璃化冷冻溶液冻存,分离复苏后的卵巢组织,三组卵母细胞的存活率分别为:26.5%、35.6%和26.1%,DMSO组高于EG5.5组和GC组,与两组相比差异均具有显著性意义(P<0.05)。3.观察DMSO组玻璃化冷冻方案冻融的卵巢组织超微结构,可见卵母细胞和颗粒细胞及细胞间隙有空泡,线粒体肿胀,但始基卵泡的卵母细胞膜完整;通过激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope ,LSCM)观察玻璃化冻融的卵巢组织分离的GV期卵母细胞体外培养成熟后的纺锤体,可见形态正常的纺锤体(纺锤体呈对称的桶型,且极性存在,染色体紧密排列在赤道板)、形态异常的微管、分布异常的染色体。实验组纺锤体正常率为35.0%,与新鲜的MⅡ期卵母细胞(纺锤体正常率为75.0%)相比差异具有显著性意义(P<0.05)。结论:在本研究采用的冷冻条件(两步法脱水、直接投入液氮)下,卵巢组织玻璃化冷冻的预平衡时间为10min形态完整的卵母细胞率最高。玻璃化冷冻不会造成卵巢组织中细胞DNA的损伤。在玻璃化冷冻中,DMSO较EG或GC更适合卵巢组织。虽然冻融过程对卵母细胞线粒体造成损伤,但分离出的GV卵母细胞经体外培养能够成熟,并且能形成正常的纺锤体。本研究所建立的无载体的小鼠卵巢组织玻璃化冷冻方法是一种简单、可行和廉价的冷冻方法,但将其应用于临床,还需进一步的研究。