苹果是经济价值较高的果树植物,是农产品的重要组成部分。苹果作为重要的种质资源,由于丰富的着色特点及形态特征,在苹果生产及果园管理中被广泛应用,其中苹果砧木进一步提高了苹果产量及果园管理效率,带来了丰富的经济效益。随着果树产品的发展趋势,苹果的矮化栽培就逐渐地成为了果树相关研究的热点。为了更好的探究苹果的矮化调控机理与生产建设,越来越多的研究者将植物的植株高度作为一项明显、直观的农艺学特性,进行相关课题的研究。其中,在苹果生产研究中,通过嫁接技术不仅提高了不同苹果品种植物对环境条件的适应力和抵抗不利环境的能力,而且也在信号传导及生理生化水平上促进了植株的生长发育。在苹果嫁接研究中,首先是要通过试验筛选不同的砧木与不同接穗之间的嫁接组合,它对后期嫁接果树的生长发育及抗性具有很大的影响,因此,对于矮化砧木的筛选尤为重要。多年来,在研究者们的不断努力下,越来越多的优良的苹果砧木品种相继被研究提出,并投入到生产应用当中,包括有M系列的矮化砧木,以及S系列、SH系列的苹果矮化砧木品种。其中应用较好的‘SH6’矮化中间砧木品种是国光苹果与武乡海棠的芽变种S19的杂交后代,与其亲本国光苹果和武乡海棠芽变种S19相比,‘SH6’能够为嫁接植株提供更稳定的抗性以及矮化优势特性。为了更好的研究果树的矮化机理,筛选优良的苹果砧木品种,许多学者对果树矮化栽培及育种进行了广泛探究,但对果树矮化的分子机理相关研究还不是很清楚。随着高新技术的发展和应用,在分子水平上,对于矮化砧木的研究也将进一步深入分析砧木矮化机理,有利于新品种的选育及应用,其中包括生长发育相关调控基因的克隆及功能分析以及调控因子之间的相互作用影响矮化砧木品种的生长发育。RNA结合蛋白(RBP)是转录后水平调控基因表达的主要承担者,在基因的转录后调控过程中,RNA结合蛋白可以与目的基因的相关元件进行结合,之后通过调控目的基因的转录水平进而影响相关基因的表达,来调控其发生相应的生理生化反应调控机制。同时,在植物的生长及发育过程中,RNA结合蛋白(RBP)也能够在蛋白调控水平上通过影响相关RNA蛋白的运输、定位及修饰,进而可能通过形成相关功能的蛋白复合物来实现植物相关路径的调控机制。赤霉素(GA)作为一种功能比较广泛的生长调节剂,它主要通过自身相关的生物合成及生物代谢等过程来实现对植物的生长和发育相关过程的调控。其中GID1作为GA代谢途径的受体,可以通过与具有活性的GA相结合进而改变了自身的分子构象,GID1发生构象改变后进一步与具有抑制作用的蛋白DELLA进行相互的作用,从而使DELLA蛋白进行泛素化修饰,进一步来诱导蛋白酶途径对抑制蛋白DELLA进行降解来调控植物的生长发育等多个方面,其中在植物的生长发育过程中,种子的萌发,植物开花时间的调控,花的成熟及发育,花期过程中的花粉管的生长及授粉均会受到GA调控路径中相关因子的影响。在本研究中,我们以苹果矮化砧木‘SH6’及其亲本国光苹果作为试验材料,通过高通量测序筛选出目的基因RBP并进行基因克隆及组织特异性表达分析,探究‘SH6’的矮化特性优势。之后通过构建过表达载体进行拟南芥突变体的稳定转化试验及‘SH6’组培苗的瞬时转化试验,并对转基因植株进行激素处理和表达分析,结果表明RBP过表达后一定程度上恢复了突变体的矮化特性,上调了赤霉素信号途径相关基因的转录水平,对植物矮化特性具有一定的调节功能。此外,通过酵母双杂交试验以及Pull-down试验进一步验证了RBP通过与GAI互作,调控赤霉素信号途径,进而影响植株矮化特性;同时,酵母单杂交试验及GID1瞬时转化试验表明,GID1可以与RBP启动子互作调控植株的生长发育。本研究从RBP功能分析出发,通过对赤霉素信号途径的互作调控,影响‘SH6’砧木的矮化特性,初步探索了苹果矮化的分子机理,为培育新的果树矮化砧木品种并应用到果树生产提供了一定理论基础。主要研究结果:(1)通过对不同品种‘SH6’矮化砧木及其亲本国光苹果的矮化特性分析可知,矮化砧木‘SH6’的株高、树冠直径、枝条周长及尖削度明显低于国光苹果的相应指标,而矮化砧木‘SH6’的节间长度以及枝皮率却明显高于国光苹果的相应指标;分析不同发育时期‘SH6’矮化砧木以及国光苹果的叶片形态表明,‘SH6’矮化砧木的叶片长度低于国光苹果,叶片宽度高于国光苹果,叶片形态趋于扁圆形,更加有利于植株生长空间的利用;此外,‘SH6’矮化砧木叶片的叶绿素含量明显的低于国光苹果,而POD酶活性高于国光苹果;通过观察不同品种的叶柄横切的解剖结构分析显示,与国光苹果相比,矮化砧木品种‘SH6’的维管组织结构和细胞壁厚度较为发达,UV光照射条件下,‘SH6’维管组织的木质素含量较国光苹果的木质素含量更多,同时,电阻率明显低于国光苹果,但净光合速率、气孔导度、蒸腾速率均高于国光苹果,因此表型分析及解剖结构表明,‘SH6’具有明显的矮化特性和矮化优势。(2)根据不同品种‘SH6’矮化砧木和国光苹果一年生枝条的芽尖提取RNA后进行三次重复的高通量测序分析。以苹果基因组为参考,进行数据库比对分析,筛选出差异调控基因RBP,经GO富集分析以及KEGG分析可知不同矮化特性品种植株的生长发育受到不同代谢路径的调控,其中包括赤霉素代谢途径等激素调控。为了进一步研究RBP的调控功能,首先我们进行了RBP基因的克隆,发现它主要与苹果中的MdRBP-8家族的基因同源性比较高,分析该基因在不同品种及组织中的表达特异性,发现RBP在矮化砧木品种‘SH6’中的表达量明显降低,进而调控了赤霉素GA3和GA4含量的下降,此外,根据目的基因RBP序列元件的分析,同样发现RBP对赤霉素信号途径存在一定的调控功能,进而一定程度上影响了植株的矮化特性。(3)为了更深入的探究RBP对赤霉素代谢路径的调控功能以及对苹果矮化特性的影响,我们将构建的RBP过表达载体进行拟南芥缺失突变体的异源转化试验,RBP过表达后明显减弱了拟南芥突变体的矮化特性,使植株株高上升,延长了植株的开花时间,同时增加了转基因株系的莲座直径以及叶片的大小,通过扫描电镜观察显示,RBP过表达后同样增加了叶片的气孔密度,提高了转基因株系叶片的叶绿素含量,降低了POD酶的活性,此外,在基因转录水平上,还进一步的上调了赤霉素合成途径的相关基因的表达水平,而下调了赤霉素信号途径中抑制蛋白GAI的表达水平。经过T3代纯合体转基因株系的筛选,我们对转基因拟南芥植株进行GA3以及抑制剂PAC处理后分析转基因植株的萌发与生长调控,结果表明,GA3处理后促进了RBP基因的转录水平,进而调控了赤霉素信号转导相关途径的基因的转录水平,促进了植株的萌发与生长,而PAC抑制了植株的萌发与生长,其中与突变体相比,RBP过表达后明显促进了植株侧根的生长,并且一定程度上对PAC的抑制作用存在抗性。我们同样对‘SH6’组培苗进行赤霉素以及抑制剂的处理,发现GA3处理后促进了RBP基因的表达水平,进而上调了赤霉素信号途径相关基因的表达,促进了‘SH6’组培苗植株的生长。(4)通过酵母双杂交以及Pull-down蛋白互作试验进一步验证了RBP与赤霉素信号途径中抑制蛋白GAI的相互作用,此外,与野生型相比,在拟南芥突变体atgai中,分析表明RBP以及赤霉素合成及代谢相关基因的表达水平明显下降,进一步说明了RBP通过与GAI的相互作用调控赤霉素代谢,影响植株的生长发育以及矮化特性。同时,我们通过酵母单杂交分析了赤霉素受体GID1与RBP启动子序列的相互作用,并通过GID1的过表达在‘SH6’组培苗中瞬时转化试验分析发现,GID1过表达后促进了RBP基因的表达,进一步上调了赤霉素代谢路径及生长素、ABA、油菜素内酯代谢路径相关基因的表达以及相关激素含量的积累。所以,RBP同样与赤霉素受体GID1存在一定的调节作用,并且不同激素间通过一定协作共同调控植株的矮化特性。