生物节律是长期自然进化而来的一种适应机制，它存在于几乎所有生物中。生物节律将机体的行为、生理状态与环境的周期变化相协调，确保机体的行为和各种生化反应高效、精确的进行。生物节律分子机制的核心是细胞中一个自主振荡的“反馈抑制回路”。CLOCK和BMAL1是哺乳动物中这个回路的核心转录因子，属于bHLH-PAS转录因子家族。实验证实，CLOCK和BMAL1需要形成异二聚体并结合于DNA的E-box元件才能激活转录。它们转录出的两类蛋白产物——Period和Cryptochrome，会共同抑制CLOCK-BMAL1的转录活性，从而降低它们自身的表达，关闭回路。随着Period和Cryptochrome的降解，新的转录过程重新开始。这一“转录激活-反馈抑制”周期大约为24小时。这个过程使得生物体在完全黑暗的环境下仍能保持大约24小时的节律。　　E-box元件是6 bp的DNA序列，它被碱性-螺旋-环-螺旋(bHLH)家族的转录因子所识别。CLOCK-BMAL1对E-box的典型模式CACGTG亲和性最高，但它们也会识别一些非典型的E-box元件激活转录，例如被称为E2或E-box的CACGTT序列。　　CLOCK和BMAL1都属于bHLH-PAS家族转录因子，它们的相似性非常高。它们如何特异性的选择形成异二聚体并不清楚。另外除了非典型的E2-box之外，CLOCK-BMAL1能否识别其他非典型E-box也不清楚。一些bHLH家族的转录因子可以识别6 bp E-box之外的侧翼DNA序列，以提高它们对DNA识别的特异性。CLOCK-BMAL1能否识别侧翼DNA序列也是我们需要回答的问题。　　我们克隆、表达、纯化了人类CLOCK和BMAL1 bHLH结构域蛋白，并获得了它们与E-box DNA的复合体晶体。我们最终解析了分辨率为2.4(A)的晶体结构。我们发现，CLOCK-BMAL1 bHLH异二聚体在溶液中会进一步寡聚化形成异四聚体。在晶体中，我们观察到两种异四聚体形式，分别由两个邻近的CLOCK分子介导和两个邻近的BMAL1分子介导。我们的实验证实CLOCK介导的异四聚体为溶液中蛋白存在的主要形式。　　为揭示CLOCK和BMAL1 bHLH结构域相互识别机制，我们分析了蛋白异二聚体互作界面。通过突变和ITC实验，我们证实CLOCK第84位组氨酸和BMAL1第125位亮氨酸对两蛋白间的相互识别起决定作用。我们的结果还表明，单独的bHLH结构域对CLOCK-BMAL1间的相互识别已经足够，而PAS结构域可能只起辅助作用。　　CLOCK-BMAL1对E-box的识别主要通过氢键介导。除此之外，我们观察到BMAL1第80位异亮氨酸和侧翼的胸腺嘧啶核苷酸之间存在一个甲基-甲基疏水相互作用。因此，CLOCK-BMAL1识别的DNA序列并非一般认为的6 bp，而是7 bp。为了找到能被CLOCK-BMAL1识别的非典型E-box序列，我们对E-box上每对碱基都做了系统的突变，并用ITC测量了蛋白与这些突变DNA间的亲和性。我们找到了两个与CLOCK-BMAL1有着高亲和性的非典型E-box模式:AACGTGA和CATGTGA，其中，第7位的腺苷酸（或第7位的胸腺嘧啶核苷酸）对蛋白-DNA间的识别必不可少。这些发现为寻找受CLOCK-BMAL1调控的DNA元件和节律基因奠定了基础。　　在蛋白碱性区磷酸化很可能会抑制蛋白与DNA结合，从而抑制转录活性。我们对CLOCK和BMAL1bHLH碱性区可能的磷酸化位点做了生物信息学预测，并研究了这些位点磷酸化后对DNA结合的影响。我们发现BMAL1第78位丝氨酸的模拟磷酸化突变能显著抑制蛋白与DNA的结合，而先前报道的CLOCK碱性区丝氨酸的模拟磷酸化突变对DNA的结合几乎没有影响。细胞实验也表明，BMAL1第78位丝氨酸的模拟磷酸化突变能有效抑制蛋白的转录功能。这个结论支持了“CLOCK-BMAL1需要经历与DNA的周期性结合调控基因表达”这个模型。