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背景:肿瘤细胞的持续高速增殖、不停转移、侵袭,顽强抵抗化疗药物的效用,很大程度上都依赖于其周身所营造的酸性缺氧微环境。此种微环境毫无疑问的会杀伤正常的机体细胞,提供违背规律的能量代谢结果。最早从1924年起,就有著名的医学家Otto Herinrich Warburg针对此非正常代谢形式提出了“Warburg Effect”学说,这种新代谢型编码程序,在现代研究认为是启动肿瘤局部缺氧、酸性环境和畸形无限生长的关键。从糖代谢的角度来切入研究抗肿瘤药品,已经成为目前结肠癌有望治愈的新希望。国医大师周仲瑛教授在长年累月的临床工作中,提炼出了具有中医基础和科学性、实用性为一体的“癌毒理论”。在“祛毒即扶正”的治疗理念下结合中药组方优势形成了集清热解毒、扶正补气、行气活血为一体的消癌解毒方。此方不管是在基础研究还是临床实践中能证实可以实现带癌共存的宗旨。本研究团队在临床运用周老消癌解毒方门诊治疗结肠癌术后患者过程中,经周仲瑛团队的帮助对消癌解毒方予以化裁,演变为固正消癌方。实践观察认为对于结肠癌患者更具有针对性和适用性,大大提高了结肠癌病患的生活质量。目的:从糖代谢及肿瘤微环境视角,探索固正消癌方押制结肠癌细胞的具体机制,从而更深入地巩固“癌毒理论”,发挥中医药抗肿瘤的优势。方法:1.细胞实验:1.1选取HT-29人结肠癌细胞系,将细胞系随机分为四组。即①空白对照组（Control）:细胞接种于含正常大鼠血清的RPMI-1640培养基中培养;②低剂量组（Low）:使用包含10%固正消癌方含药血清的RPMI-1640培养基培养;③中剂量组（Medium）:使用包含20%固正消癌方含药血清的RPMI-1640培养基培养;④高剂量组（High）:使用包含30%固正消癌方含药血清的RPMI-1640培养基培养。观察不同分组培养12h、24h的HT-29细胞Transwell实验情况;测定4个分组干预48h后的葡萄糖含量和乳酸水平、乳酸脱氢酶含量（LDH）、HT-29细胞内、外pH的影响、72h后的各组中ATP的浓度;利用Western Blot检测不同分组下低氧诱导因子1α（HIF-1α）、细胞能量感受器AMPK α1、磷酸化的AMPKα1（p-AMPK α1）、己糖激酶（HK2）;以AnnexinV-FITC/PI双标记法流式细胞术检测HT-29细胞的凋亡率。1.2选取HT-29人结肠癌细胞系,将细胞系随机分为四组。即①空白对照组（Control）:HT-29细胞接种于含正常大鼠血清的RPMI-1640培养基中培养;②高剂量组（High）:使用包含30%固正消癌方含药血清的RPMI-1640培养基培养HT-29细胞;③高剂量合并小分子干扰AMPK（High+Si-AMPK）组:以包含30%固正消癌方含药血清的RPMI-1640培养基与特异性沉默AMPK技术结合,对HT-29细胞共同作用。④高剂量合并AMPK激动剂（High+AMPK activator）组:使用包含30%固正消癌方含药血清的RPMI-1640与AMPK激动剂AICAR共同作用HT-29细胞。计算不同分组下培养24h、48h、72h后细胞的OD值;4个分组下对HT-29细胞进行划痕和Transwell实验观察12h、24h的迁移和侵袭能力;利用Western Blot检测不同分组下HIF-1α、葡萄糖转运蛋白4（Glut4）、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及p53的表达情况。2.动物实验:选取HT-29人结肠癌细胞系构建荷瘤裸鼠模型,随机分为5组,每组8只,雌雄各半。即空白对照组、模型组、低剂量固正消癌方组（5g/kg）、中剂量固正消癌方组（10g/kg）、高剂量固正消癌方组（20g/kg）。药物干预14天,处死裸鼠后进行肝、肾、脾脏的HE染色;瘤体组织的免疫组化检测Cleaved-caspase-3、HIF-1α、HK2、Ki67、p-AMPK α1的表达;利用Western Blot检测瘤体内AMPKα1、p-AMPKα1、HIF-1α、HK2、Glut4蛋白情况;对模型组、低剂量组、高剂量组内裸鼠末次给药后2h取血清进行糖代谢组学液相色谱、质谱联用技术（Liquid ChromatograpH Mass Sepctrometer,LC-MS）分析。结果:1.细胞实验:在细胞体外实验中发现,不同分组药物干预后证实固正消癌方能抑制肿瘤细胞Transwell侵袭、迁移能力;ATP浓度测定结果显示固正消癌方含药血清浓度与ATP的浓度呈反比,固正消癌方含药血清浓度越高,ATP的浓度就越低;当固正消癌方含药血清达到一定药物浓度时,可以降低HT-29细胞对葡萄糖的获取,减慢糖代谢进程;同时,固正消癌方也能相应的降低HT-29细胞产生的乳酸以及限制LDH的表达;固正消癌方含药血清可以下降细胞内的pH值,缩小细胞内外pH差值,且随着固正消癌方含药血清干预浓度的上升而作用效果增强;固正消癌方含药血清可以下调HK2、HIF-1α蛋白的表达,明显激活AMPK的信号通路,调节HT-29细胞的代谢方式;Annexin—FITC/PI流式细胞术亦证实固正消癌方可以呈剂量依赖性方式发挥抑制HT-29细胞增殖的作用。在固正消癌方含药血清对HT-29细胞AMPK通路影响的细胞实验研究结果中可知,High组HT-29细胞的增殖情况弱于High+Si-AMPK组,但是High组HT-29细胞的增殖情况强于High+AMPK activator组,说明固正消癌方含药血清可以通过激活AMPK信号通路作用HT-29细胞,且其抑制肿瘤细胞的程度受活化的AMPK数量的影响;同时,固正消癌方含药血清可以通过激活AMPK通路弱化HT-29细胞的迁移、侵袭能力;High组Western Blot结果显示:Glut4明显表达受到抑制,弱于Control组（P<0.05）;High+Si-AMPK 组的 Glut4 表达强于 High 组（P<0.05）;High+AMPK activator 组的 Glut4 表达又弱于High组。说明,固正消癌方含药血清可以通过AMPK通路调控Glut4蛋白的表达,从而抑制HT-29细胞的糖代谢。High组与Control组的HIF-1α表达量未见差异,High+Si-AMPK组与High组的HIF-1α得表达也未见差异;High+AMPK activator组的HIF-1α表达却明显低于High组（P<0.05）。High组的p53蛋白表达明显高于Control组（P<0.05）,High+AMPK activator组的p53含量亦多于High组（P<0.05）,说明p53依赖于活化的AMPK发挥抗肿瘤作用;而相反地,抑制HT-29细胞中的AMPK,会使得High+Si-AMPK组内p53表达量下凋,影响HT-29细胞的凋亡。High+Si-AMPK组的Bcl-2表达高于High组（P<0.05）,在AMPK被沉默后,HT-29细胞增殖程度会提高。在High+AMPK activator组内的Bax含量高于High组,但无统计学差异;然而,High+AMPK activator组内的Bcl-2表达量低于High组（P<0.05）,可以认为在AMPK活化达到一定程度时能够促进HT-29细胞的凋亡,其结果与AMPK可能影响下游Bcl-2通路有关。2.动物实验在荷瘤裸鼠的体内实验中可知,固正消癌方对肝、脾、肾脏无明显损害;瘤体组织的免疫组化检测显示固正消癌方会下调Ki67、HIF-1α、HK2蛋白及促进Cleaved-caspase-3、p-AMPK α1蛋白的表达,以此通过限制糖代谢来控制瘤体细胞的增殖,促进其凋亡;Western Blot检测显示固正消癌方也同样会激活AMPK通路,限制糖代谢相关酶HIF-1α、HK2、Glut4的表达,磷酸化p53,诱发结肠癌细胞程序性凋亡。模型组、低剂量组、高剂量组内裸鼠血清LC-MS分析:各分组区分聚集性明显,筛选出5种差异糖类代谢产物分别是甘露糖（Mannose）、葡萄糖（Glucose）、阿拉伯糖（Arabinose）、岩藻糖（Fucose）、果糖（Fructose）以及多条信号通路比如:ABC转运蛋白通路、半乳糖的代谢途径。结论:1)固正消癌方可以从糖代谢途径减少结肠癌细胞的能量来源,改善其周围的微酸环境,下调相关蛋白等方面起到抗肿瘤作用。2)在固正消癌方的作用下,AMPK通路的激活也会起到干预结肠癌细胞的糖代谢过程,诱导细胞凋亡的作用。3)LC-MS分析认为固正消癌方作用下的差异糖类代谢物为甘露糖（Mannose）、葡萄糖（Glucose）、阿拉伯糖（Arabinose）、岩藻糖（Fucose）、果糖（Fructose）,以此为靶点的信号通路还包括ABC转运蛋白通路、半乳糖的代谢途径等。