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目的:本研究旨在探讨谷氨酰胺(glutamine,Gln)缺乏对宫颈癌Hela细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其相关机制;并进一步研究宫颈癌Hela细胞在谷氨酰胺缺乏的条件下,PHGDH的表达情况及进一步沉默PHGDH后对宫颈癌Hela细胞增殖的影响及其相关作用机制。研究方法:1、应用CCK8方法检测在不同浓度(0/0.1/0.5/1/2/4mmol/L)Gln的条件下培养48h,检测Hela细胞的生长情况,继续培养48h后,再用CCK8方法检测各组细胞生长情况。2、应用细胞划痕实验观察在不同浓度(0/0.1/0.5/1/2/4mmol/L)Gln的培养条件下Hela细胞迁移能力变化情况。3、应用PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I方法检测在不同浓度(0/0.1/0.5/1/2/4mmol/L)Gln的条件下培养48h后Hela细胞凋亡情况。4、应用流式细胞法检测在不同浓度(0/0.1/0.5/1/2/4mmol/L)Gln的条件下培养48h后Hela细胞内ROS水平。5、应用慢病毒转染RNA干扰技术抑制宫颈癌Hela细胞中PHGDH的表达,构建PHGDHsh RNA基因沉默细胞模型。荧光显微镜及Werstern blot检测转染效率及转染后细胞内PHGDH的表达情况。6、应用CCK8方法检测Hela、Helavec和Helash-PHGDH在不同浓度(0/0.1/0.5/1/2/4mmol/L)Gln的条件下培养48h和96h,检测各组细胞的生长情况。7、应用PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I方法检测Hela、Helavec和Helash-PHGDH细胞凋亡情况。8、应用Werstern blot方法检测在不同浓度(0/0.1/0.5/1/2/4mmol/L)Gln的条件下培养48h后Hela细胞内PHGDH蛋白表达情况。9、应用流式细胞法检测在不同浓度(0mmol/L/4mmol/L)Gln的条件下培养48h后Hela、Helavec和Helash-PHGDH细胞内ROS的情况。10、用GSH/GSSGTM Assay(premega公司)试剂盒检测Hela和Helash-PHGDH在不同浓度(0mmol/L/4mmol/L)Gln的条件下培养48h后细胞内GSH/GSSG比值。11、用Total NADP and NADPH Assay试剂盒(Abcom公司)检测在不同浓度(0/0.1/0.5/1/2/4mmol/L)Gln的条件下培养48h后Hela细胞内NADP/NADPH比值变化情况,以及Hela、Helavec和Helash-PHGDH细胞内NADP/NADPH比值。结果:1、在谷氨酰胺缺乏的条件下,Hela细胞的生长受到抑制(P<0.05),且谷氨酰胺浓度越低,对Hela细胞生长抑制越大;继续培养48h后,进一步加重对Hela细胞生长抑制。2、在划痕实验中,随着培养基中谷氨酰胺浓度的降低,Hela细胞的伤口愈合率也越小(P<0.05)。3、谷氨酰胺浓度<0.5mmol/L时Hela细胞的凋亡数目明显升高(P<0.05)。4、谷氨酰胺<1mmol/L时,Hela细胞内的ROS水平显著升高(P<0.05)。5、CCK8法结果显示在同一Gln浓度下,Helash-PHGDH组细胞的生长抑制率明显比Helavec组和Hela组升高(P<0.05),Helavec组和Hela组的细胞生长抑制率无明显差别。6、当谷氨酰胺缺乏的条件下,Hela细胞的生长受到抑制(P<0.05),沉默PHGDH后进一步抑制宫颈癌Hela细胞生长,继续培养48h后,进一步抑制细胞生长。7、Helash-PHGDH组明显比Hela组和Helavec组细胞凋亡数目多(P<0.05)。8、Werstern blot结果显示谷氨酰胺缺乏时Hela细胞中PHGDH蛋白表达量明显升高(P<0.05)。9、Helash-PHGDH组在4/0mmol/LGln条件下培养后细胞内ROS水平明显高于Helavec组和Hela组(P<0.05),Helavec组和Hela组没有明显差别。相比于4mmol/L Gln培养环境,0mmol/L Gln培养条件也导致各组细胞内ROS水平升高(P<0.05)。10、Hela/4mmol/L Gln组、Hela/0mmol/L Gln组、Helash-PHGDH/4mmol/L Gln组和Hela-sh PHGDH/0mmol/L Gln组细胞内GSH/GSSG比值分别为46.87±1.25、13.59±1.83、10.99±0.75、3.50±2.57,且差异具有统计学意义(P<0.05)。11、在Gln<2mmol/L时,Hela组细胞内NADP/NADPH比值开始升高,且差异具有统计学意义(P<0.05),但是Hela、Helavec和Helash-PHGDH细胞内NADP/NADPH比值无明显差别。结论:1、谷氨酰胺缺乏引起细胞内ROS水平升高是影响hela细胞生长增殖迁移和凋亡一个因素。2、沉默PHGDH可抑制宫颈癌Hela细胞增殖并诱导其凋亡。3、在谷氨酰胺缺乏的条件下,沉默PHGDH后进一步抑制Hela细胞增殖。4、谷氨酰胺缺乏激活PHGDH蛋白高表达来调节GSH/GSSG比值和ROS水平维持细胞内氧化还原状态以支持宫颈癌Hela细胞生长。