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肺炎支原体肺炎(Mycoplasma Pneumoniae Pneumonia，MPP)在儿童社区获得性肺炎(Community Acquired Pneumonia，CAP)中是一种常见病、发病率相对较高，可持续散发或不定期流行，约每隔3-7年可呈现一次周期性流行。流行期间，高达40％甚至更高比例的CAP由肺炎支原体(Mycoplasma Pneumoniae，MP)感染所致。儿童病情轻重不一，近年来对难治性MPP的报道增多，其具体发病机制尚不十分明确，目前普遍认为与MP对局部黏膜的直接侵袭和机体产生强烈的炎症反应有关。
MP的结构不同于细菌，由于缺乏细胞壁，而不能通过脂多糖、肽聚糖或者脂磷壁酸等诱发炎症。目前研究认为MP的脂蛋白是诱发机体炎症，促使肺炎发生的主要因素之一。巨噬细胞活化脂肽-2(Macrophage-activation Lipidpeptide-2,MALP-2)，是支原体脂质相关膜蛋白的主要成分，主要结合巨噬细胞细胞膜上的Toll样受体2/6，激活多种蛋白激酶途径，诱导炎症因子的释放。因此通过对MALP-2的研究可更好的认识和预防支原体的危害。
由于MPP患儿存在强烈的炎症反应，在儿童难治性MPP的治疗中，常应用甲泼尼龙等糖皮质激素抗炎，但其抑制患儿的免疫功能，增加感染的风险。因此寻找一种天然的物质取代或减少糖皮质激素的应用，是临床医师面临的重要挑战。乳铁蛋白是一种相对分子质量为80kDa的糖蛋白，存在于多种哺乳动物中，含有约700个氨基酸，不同物种间具有高度的同源性。一些乳铁蛋白的活性研究表明，乳铁蛋白是具有抗菌抗炎作用的化合物，可以单独或作为常规抗生素的辅助用药。牛乳铁蛋白(Bovine Lactoferrin，BLF)与人乳铁蛋白具有高度的序列同源性，更容易从牛奶中提取，因此具有很高的研究价值。
本研究分为三部分，第一、第二部分为临床部分，旨在总结儿童MPP伴气道阻塞形成的临床特征及与MP-DNA载量的相关性；并观察血与肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)炎症因子、机体免疫功能相关指标的变化，分析气道阻塞形成的原因；第三部分为动物实验，应用支原体膜脂蛋白MALP-2制作小鼠急性肺损伤的模型，探索急性期短期应用BLF对肺损伤的保护作用及其可能的机制，为临床治疗MPP提供新思路。
第一部分儿童肺炎支原体肺炎伴气道阻塞的临床特征及与MP-DNA载量的相关性分析
目的：了解儿童MPP伴气道阻塞的临床特征，并分析其与肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)中MP-DNA载量的相关性，有助于提高对气道阻塞的早期识别及治疗，缩短病程，减少后遗症。
方法：纳入2015年10月-2017年1月住院行纤维支气管镜检查及治疗的MPP患儿共219例。根据纤维支气管镜下情况分为气道阻塞组与非气道阻塞组，对比两组患儿的一般情况、临床特征、实验室检查及BALF中MP-DNA的载量。应用Logistic回归分析模型评估乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)、谷丙转氨酶(Alanine Transaminase,ALT)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、中性粒细胞所占百分比(Neutrophil Cells Percentage,N%)等主要实验室指标对患儿气道阻塞的影响。采用Spearman秩相关分析对MP-DNA载量与两组有差异的临床及实验室指标做相关性分析。以MP-DNA载量为检验变量，气道阻塞为状态变量，获得ROC曲线，评估其预测价值。
结果：
1.共73例MPP伴气道阻塞患儿与146例非气道阻塞患儿。与非气道阻塞组相比，气道阻塞组患儿的发热时间(P=0.005)及住院时间(P=0.003)更长；T≥40℃患儿(P=0.000)、胸腔积液(P=0.003)、难治性MPP(P=0.000)所占的比例更高；女孩多见(P=0.035)。实验室指标分析结果显示，气道阻塞组的BALF中MP-DNA载量(P=0.000)和血浆中LDH(P=0.000)、CRP(P=0.042)、N%(P=0.007)、ALT水平(P=0.000)较非气道阻塞组显著增高。
2.Logistic回归分析结果提示BALF中MP-DNA载量(95%置信区间：1.439-3.218，OR值:2.152，P=0.000)和血浆中LDH(95%置信区间：1.003-1.007，OR值:1.005，P=0.000)是气道阻塞的独立危险因素。Spearman秩相关分析结果提示，患儿BALF中MP-DNA载量与血浆中LDH(相关系数0.206;P=0.002)、ALT(相关系数0.238;P=0.000)、CRP(相关系数0.195;P=0.004)、总热程(相关系数0.246;P=0.000)、住院天数(相关系数0.272;P=0.000)相关。MP-DNA载量预测气道阻塞的ROC曲线下面积为0.736(95%CI:0.667-0.806,P=0.000)。最佳截断值为MP-DNA的拷贝数为107(灵敏度=69.9%,特异度=70.5%)。
3.73例气道阻塞患儿中取出物表现为支气管塑型26例，黏液栓47例。阻塞位置均位于段以下的支气管。与非气道阻塞患儿相比，治疗时联合甲泼尼龙琥珀酸钠的比例更高(87.8%vs49.3%，P=0.000)。其中44例患儿应用支气管肺泡灌洗、负压吸引不能有效清除阻塞，联合应用了细胞刷或异物钳治疗，3例气道黏膜糜烂患儿出现少量出血。与黏液栓患儿相比，支气管塑型患儿的热程、CRP、N%、ALT等指标均无显著差异(P＞0.05)。
小结：
1.与非气道阻塞相比，气道阻塞的MPP患儿发热及住院时间更长，高热患儿所占比例更多，更容易合并胸腔积液，形成RMPP、坏死性肺炎等。患儿的LDH、CRP、N%、ALT等炎症指标水平更高,更多的患儿联合了糖皮质激素治疗。
2.气道阻塞位于段支气管以下，可表现为黏液栓或支气管塑型样物，女孩多见,支气管肺泡灌洗联合细胞刷或异物钳清理气道，无严重并发症。
3.气道阻塞患儿BALF中MP-DNA的载量增高，且与发热时间、住院时间、LDH、CRP、ALT等指标相关，对气道阻塞有一定的预测价值，气道阻塞形成的原因可能与局部MP的载量有关。
第二部分儿童肺炎支原体肺炎伴气道阻塞炎症因子及免疫功能分析
目的：观察气道阻塞MPP患儿血清和BALF中炎症因子表达情况，同时分析与免疫功能相关的指标，并与非气道阻塞患儿对比分析,为探索MPP造成气道阻塞的发病机制与干预手段提供新的思路。
方法：纳入2018年3月至2018年11月肺部影像表现为肺实变伴肺不张行支气管镜治疗的MPP患儿，根据支气管镜下表现分为气道阻塞组与非气道阻塞组。纳入研究对象入院24小时内采集血标本进行免疫球蛋白、淋巴细胞亚群分析。支气管镜治疗当天采集血液及BALF应用流式荧光技术分别进行白细胞介素2(Interleukin-2, IL-2)、白细胞介素4(Interleukin-4, IL-4)、白细胞介素6(Interleukin-6, IL-6)、白细胞介素10(Interleukin-10, IL-10)、γ干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TumourNecrosisFactor-alpha，TNF-α)测定，分析比较两组患儿免疫功能相关指标、BALF及外周血6种细胞因子的差异。
结果:
1.共纳入患儿56例，其中气道阻塞25例，非气道阻塞31例。气道阻塞组，男15例，女10例，平均年龄6.2±1.9岁，入院前病程7.8±2.3天；非气道阻塞组，男16例，女15例，平均年龄5.7±2.3岁,入院前病程7.9±2.3天。两组患儿的年龄、性别、入院时的病程差异均无统计学意义(P＞0.05)，两组患儿的基线资料一致，具有可比性。
2.与非气道阻塞患儿相比，MPP伴气道阻塞患儿BALF中IL-6、TNF-α、IFN-γ三种细胞因子浓度均显著升高(P＜0.01)，IFNγ/IL4比值显著增高(P<0.01)。而血浆中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ浓度均无明显差异(P＞0.05)。
3.两组患儿血中总T细胞(CD3+)、辅助性T细胞(CD4+)、杀伤性T细胞(CD8+)、辅助性T/杀伤性T(CD4/CD8)、总B细胞(CD19+)、自然杀伤淋巴细胞(CD56+),与IgG、IgM、IgA等均无显著差异(P＞0.05)。
小结：
1.儿童MPP伴气道阻塞的形成可能与感染局部IL-6、TNF-α、IFN-γ的升高有关，而与患儿外周血的总淋巴细胞比例和IgG、IgM、IgA等免疫相关的指标可能无关。
2.MPP伴气道阻塞患儿BALF中IFN-γ/IL-4比值明显增高，提示这些患儿存在更为严重的局部Th1/Th2细胞免疫失衡。
第三部分牛乳铁蛋白对MALP-2致小鼠急性肺损伤的保护作用与机制研究
目的：探索牛乳铁蛋白对支原体膜脂蛋白MALP-2诱导的急性肺损伤的保护作用及可能机制，为探索治疗MPP提供可能的药物选择。
方法：
1.动物分组及干预方案：采用随机对照试验方法，将36只BALB/c小鼠,按随机数字表随机分为4组(n=9)：生理盐水空白对照组(NS组)、MALP-2模型组(M组)、牛乳铁蛋白1组(BLFl组，100mg／kg)，牛乳铁蛋白2组(BLF2组，200mg／kg)。MALP-2模型组每只BALB/c小鼠经气管缓慢给予用30μL生理盐水溶解的MALP-21μg，并将小鼠垂直放置，防止呛咳;0.5h后腹腔注射生理盐水0.1ml，间隔24小时给药1次，连续3次。生理盐水对照组同样方法暴露气管，每只小鼠经气管给予30μL生理盐水；0.5h后腹腔注射生理盐水0.1ml，间隔24小时给药1次，连续3次。牛乳铁蛋白1组每只BALB/c小鼠以同样方式气管内缓慢给予用30μL生理盐水溶解的MALP-21μg；0.5h后腹腔注射100mg/kg用生理盐水溶解的牛乳铁蛋白0.1ml，间隔24小时给药1次，连续3次。牛乳铁蛋白2组每只BALB/c小鼠气管内缓慢给予用30μL生理盐水溶解的MALP-21μg；0.5h后腹腔注射200mg/kg用生理盐水溶解的牛乳铁蛋白0.1ml，连续3次。
2.检测指标及方法：光学显微镜观察肺组织病理结构改变；酶联免疫吸附测定各组小鼠肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)中IL-6、IL-4、IFN-γ的浓度；免疫印迹法(Western blot, WB)检测各组肺组织TLR2、NF-κBp65的表达。
3.统计学分析：对所有数据采用SPSS17.0进行统计分析。计量资料数据用均数±标准差(mean±SD)来表示。采用单因素方差分析(One-Way analysis of variance，One-Way ANOVA)中的最小显著差异(least signifcant difference,LSD)统计各组之间的差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
1.光镜下观察肺组织HE染色：NS组小鼠肺泡结构相对完整，肺泡腔清晰可见、未见炎性渗出，偶有炎症细胞浸润在支气管和血管周围及肺泡间隔；M组小鼠肺组织结构损伤严重，肺泡结构破坏较多、部分肺泡融合，肺间质增厚、肺泡腔有渗出，肺泡壁明显水肿,可见大量炎性细胞浸润，偶见分叶明显的中性粒细胞。乳铁蛋白组亦均有不同程度的肺组织损伤，但较M组肺组织损伤减轻，其肺泡组织结构相对完整，肺间质和肺泡腔内渗出物较M组明显减少，炎性细胞浸润现象亦减轻。与BLF2组相比，BLF1组的组织损伤更重一些。
2.小鼠BALF细胞因子测定：MALP-2所致的小鼠肺损伤模型BALF中IL-6、IFN-γ的水平在各组间存在明显差异。与NS组BALF中IL-6(64.65±4.80)、IFN-γ(162.25±41.14)水平相比，M组IL-6(431.17±110.3)、IFN-γ(1336.75±338.90)水平均显著增高(P＜0.05)。与M组BALF中IL-6(431.17±110.39)、IFN-γ(1336.75±338.90)水平相比，BLF2组IL-6(74.03±25.04)、IFN-γ(142.42±20.05)水平均显著减低(P＜0.05)；BLF1组IL-6(315.07±101.39)、IFN-γ(254.53±35.29)亦均明显减低(P＜0.05)。各组BALF中IL-4的水平无显著差异(P＞0.05)。
3.各组TLR2与NF-κBp65的表达情况
WB检测MALP-2致小鼠急性肺损伤模型BLF组与M组肺组织中NF-κBp65与TLR2蛋白水平存在显著差异。与M组相比，TLR2/β-actin的比值在BLF2组(0.19±0.05vs0.88±0.16，P=0.000)、BLF1组(0.64±0.06vs0.88±0.16，P=0.01)均显著减低；与BLF1组相比，BLF2组TLR2/β-actin的比值(0.19±0.05vs0.64±0.06,P=0.000)也显著减低。与M组相比，NF-κBp65/β-actin的比值在BLF2组(0.36±0.24vs0.87±0.21P=0.007)显著减低；在BLF1组(0.62±0.15vs0.87±0.21，P=0.114)也有减低趋势，但差异无统计学意义；BLF2组与BLF1组相比(0.36±0.24vs0.62±0.15,P=0.110)有减低趋势，但差异无统计学意义。
小结：牛乳铁蛋白可减轻MALP-2所致的小鼠急性肺损伤，降低BALF中IL-6、IFN-γ的水平，其作用机制可能与抑制TLR2/NF-κB炎症通路有关。
结论：
1.儿童MPP伴气道阻塞，表现为黏液栓或支气管塑型，阻塞的部位在段以下的支气管，女孩多见，可采用支气管肺泡灌洗联合细胞刷或异物钳清理气道，无严重并发症。气道阻塞患儿炎症指标水平更高，更容易形成难治性MPP,更多的患儿接受了糖皮质激素的治疗。气道阻塞形成的原因可能与局部MP的载量有关。
2.与非气道阻塞患儿相比，MPP伴气道阻塞患儿BALF中IL-6、TNF-α、IFN-γ的水平升高，IFN-γ/IL-4比值明显增高，感染局部可能存在更为严重的Th1/Th2细胞免疫失衡。
3.牛乳铁蛋白可减轻支原体膜脂蛋白MALP-2所致的小鼠急性肺损伤，降低BALF中IL-6、IFN-γ的水平。其作用机制可能与抑制TLR2/NF-κB炎症通路有关。
MP的结构不同于细菌，由于缺乏细胞壁，而不能通过脂多糖、肽聚糖或者脂磷壁酸等诱发炎症。目前研究认为MP的脂蛋白是诱发机体炎症，促使肺炎发生的主要因素之一。巨噬细胞活化脂肽-2(Macrophage-activation Lipidpeptide-2,MALP-2)，是支原体脂质相关膜蛋白的主要成分，主要结合巨噬细胞细胞膜上的Toll样受体2/6，激活多种蛋白激酶途径，诱导炎症因子的释放。因此通过对MALP-2的研究可更好的认识和预防支原体的危害。
由于MPP患儿存在强烈的炎症反应，在儿童难治性MPP的治疗中，常应用甲泼尼龙等糖皮质激素抗炎，但其抑制患儿的免疫功能，增加感染的风险。因此寻找一种天然的物质取代或减少糖皮质激素的应用，是临床医师面临的重要挑战。乳铁蛋白是一种相对分子质量为80kDa的糖蛋白，存在于多种哺乳动物中，含有约700个氨基酸，不同物种间具有高度的同源性。一些乳铁蛋白的活性研究表明，乳铁蛋白是具有抗菌抗炎作用的化合物，可以单独或作为常规抗生素的辅助用药。牛乳铁蛋白(Bovine Lactoferrin，BLF)与人乳铁蛋白具有高度的序列同源性，更容易从牛奶中提取，因此具有很高的研究价值。
本研究分为三部分，第一、第二部分为临床部分，旨在总结儿童MPP伴气道阻塞形成的临床特征及与MP-DNA载量的相关性；并观察血与肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)炎症因子、机体免疫功能相关指标的变化，分析气道阻塞形成的原因；第三部分为动物实验，应用支原体膜脂蛋白MALP-2制作小鼠急性肺损伤的模型，探索急性期短期应用BLF对肺损伤的保护作用及其可能的机制，为临床治疗MPP提供新思路。
第一部分儿童肺炎支原体肺炎伴气道阻塞的临床特征及与MP-DNA载量的相关性分析
目的：了解儿童MPP伴气道阻塞的临床特征，并分析其与肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)中MP-DNA载量的相关性，有助于提高对气道阻塞的早期识别及治疗，缩短病程，减少后遗症。
方法：纳入2015年10月-2017年1月住院行纤维支气管镜检查及治疗的MPP患儿共219例。根据纤维支气管镜下情况分为气道阻塞组与非气道阻塞组，对比两组患儿的一般情况、临床特征、实验室检查及BALF中MP-DNA的载量。应用Logistic回归分析模型评估乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)、谷丙转氨酶(Alanine Transaminase,ALT)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、中性粒细胞所占百分比(Neutrophil Cells Percentage,N%)等主要实验室指标对患儿气道阻塞的影响。采用Spearman秩相关分析对MP-DNA载量与两组有差异的临床及实验室指标做相关性分析。以MP-DNA载量为检验变量，气道阻塞为状态变量，获得ROC曲线，评估其预测价值。
结果：
1.共73例MPP伴气道阻塞患儿与146例非气道阻塞患儿。与非气道阻塞组相比，气道阻塞组患儿的发热时间(P=0.005)及住院时间(P=0.003)更长；T≥40℃患儿(P=0.000)、胸腔积液(P=0.003)、难治性MPP(P=0.000)所占的比例更高；女孩多见(P=0.035)。实验室指标分析结果显示，气道阻塞组的BALF中MP-DNA载量(P=0.000)和血浆中LDH(P=0.000)、CRP(P=0.042)、N%(P=0.007)、ALT水平(P=0.000)较非气道阻塞组显著增高。
2.Logistic回归分析结果提示BALF中MP-DNA载量(95%置信区间：1.439-3.218，OR值:2.152，P=0.000)和血浆中LDH(95%置信区间：1.003-1.007，OR值:1.005，P=0.000)是气道阻塞的独立危险因素。Spearman秩相关分析结果提示，患儿BALF中MP-DNA载量与血浆中LDH(相关系数0.206;P=0.002)、ALT(相关系数0.238;P=0.000)、CRP(相关系数0.195;P=0.004)、总热程(相关系数0.246;P=0.000)、住院天数(相关系数0.272;P=0.000)相关。MP-DNA载量预测气道阻塞的ROC曲线下面积为0.736(95%CI:0.667-0.806,P=0.000)。最佳截断值为MP-DNA的拷贝数为107(灵敏度=69.9%,特异度=70.5%)。
3.73例气道阻塞患儿中取出物表现为支气管塑型26例，黏液栓47例。阻塞位置均位于段以下的支气管。与非气道阻塞患儿相比，治疗时联合甲泼尼龙琥珀酸钠的比例更高(87.8%vs49.3%，P=0.000)。其中44例患儿应用支气管肺泡灌洗、负压吸引不能有效清除阻塞，联合应用了细胞刷或异物钳治疗，3例气道黏膜糜烂患儿出现少量出血。与黏液栓患儿相比，支气管塑型患儿的热程、CRP、N%、ALT等指标均无显著差异(P＞0.05)。
小结：
1.与非气道阻塞相比，气道阻塞的MPP患儿发热及住院时间更长，高热患儿所占比例更多，更容易合并胸腔积液，形成RMPP、坏死性肺炎等。患儿的LDH、CRP、N%、ALT等炎症指标水平更高,更多的患儿联合了糖皮质激素治疗。
2.气道阻塞位于段支气管以下，可表现为黏液栓或支气管塑型样物，女孩多见,支气管肺泡灌洗联合细胞刷或异物钳清理气道，无严重并发症。
3.气道阻塞患儿BALF中MP-DNA的载量增高，且与发热时间、住院时间、LDH、CRP、ALT等指标相关，对气道阻塞有一定的预测价值，气道阻塞形成的原因可能与局部MP的载量有关。
第二部分儿童肺炎支原体肺炎伴气道阻塞炎症因子及免疫功能分析
目的：观察气道阻塞MPP患儿血清和BALF中炎症因子表达情况，同时分析与免疫功能相关的指标，并与非气道阻塞患儿对比分析,为探索MPP造成气道阻塞的发病机制与干预手段提供新的思路。
方法：纳入2018年3月至2018年11月肺部影像表现为肺实变伴肺不张行支气管镜治疗的MPP患儿，根据支气管镜下表现分为气道阻塞组与非气道阻塞组。纳入研究对象入院24小时内采集血标本进行免疫球蛋白、淋巴细胞亚群分析。支气管镜治疗当天采集血液及BALF应用流式荧光技术分别进行白细胞介素2(Interleukin-2, IL-2)、白细胞介素4(Interleukin-4, IL-4)、白细胞介素6(Interleukin-6, IL-6)、白细胞介素10(Interleukin-10, IL-10)、γ干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TumourNecrosisFactor-alpha，TNF-α)测定，分析比较两组患儿免疫功能相关指标、BALF及外周血6种细胞因子的差异。
结果:
1.共纳入患儿56例，其中气道阻塞25例，非气道阻塞31例。气道阻塞组，男15例，女10例，平均年龄6.2±1.9岁，入院前病程7.8±2.3天；非气道阻塞组，男16例，女15例，平均年龄5.7±2.3岁,入院前病程7.9±2.3天。两组患儿的年龄、性别、入院时的病程差异均无统计学意义(P＞0.05)，两组患儿的基线资料一致，具有可比性。
2.与非气道阻塞患儿相比，MPP伴气道阻塞患儿BALF中IL-6、TNF-α、IFN-γ三种细胞因子浓度均显著升高(P＜0.01)，IFNγ/IL4比值显著增高(P<0.01)。而血浆中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ浓度均无明显差异(P＞0.05)。
3.两组患儿血中总T细胞(CD3+)、辅助性T细胞(CD4+)、杀伤性T细胞(CD8+)、辅助性T/杀伤性T(CD4/CD8)、总B细胞(CD19+)、自然杀伤淋巴细胞(CD56+),与IgG、IgM、IgA等均无显著差异(P＞0.05)。
小结：
1.儿童MPP伴气道阻塞的形成可能与感染局部IL-6、TNF-α、IFN-γ的升高有关，而与患儿外周血的总淋巴细胞比例和IgG、IgM、IgA等免疫相关的指标可能无关。
2.MPP伴气道阻塞患儿BALF中IFN-γ/IL-4比值明显增高，提示这些患儿存在更为严重的局部Th1/Th2细胞免疫失衡。
第三部分牛乳铁蛋白对MALP-2致小鼠急性肺损伤的保护作用与机制研究
目的：探索牛乳铁蛋白对支原体膜脂蛋白MALP-2诱导的急性肺损伤的保护作用及可能机制，为探索治疗MPP提供可能的药物选择。
方法：
1.动物分组及干预方案：采用随机对照试验方法，将36只BALB/c小鼠,按随机数字表随机分为4组(n=9)：生理盐水空白对照组(NS组)、MALP-2模型组(M组)、牛乳铁蛋白1组(BLFl组，100mg／kg)，牛乳铁蛋白2组(BLF2组，200mg／kg)。MALP-2模型组每只BALB/c小鼠经气管缓慢给予用30μL生理盐水溶解的MALP-21μg，并将小鼠垂直放置，防止呛咳;0.5h后腹腔注射生理盐水0.1ml，间隔24小时给药1次，连续3次。生理盐水对照组同样方法暴露气管，每只小鼠经气管给予30μL生理盐水；0.5h后腹腔注射生理盐水0.1ml，间隔24小时给药1次，连续3次。牛乳铁蛋白1组每只BALB/c小鼠以同样方式气管内缓慢给予用30μL生理盐水溶解的MALP-21μg；0.5h后腹腔注射100mg/kg用生理盐水溶解的牛乳铁蛋白0.1ml，间隔24小时给药1次，连续3次。牛乳铁蛋白2组每只BALB/c小鼠气管内缓慢给予用30μL生理盐水溶解的MALP-21μg；0.5h后腹腔注射200mg/kg用生理盐水溶解的牛乳铁蛋白0.1ml，连续3次。
2.检测指标及方法：光学显微镜观察肺组织病理结构改变；酶联免疫吸附测定各组小鼠肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)中IL-6、IL-4、IFN-γ的浓度；免疫印迹法(Western blot, WB)检测各组肺组织TLR2、NF-κBp65的表达。
3.统计学分析：对所有数据采用SPSS17.0进行统计分析。计量资料数据用均数±标准差(mean±SD)来表示。采用单因素方差分析(One-Way analysis of variance，One-Way ANOVA)中的最小显著差异(least signifcant difference,LSD)统计各组之间的差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
1.光镜下观察肺组织HE染色：NS组小鼠肺泡结构相对完整，肺泡腔清晰可见、未见炎性渗出，偶有炎症细胞浸润在支气管和血管周围及肺泡间隔；M组小鼠肺组织结构损伤严重，肺泡结构破坏较多、部分肺泡融合，肺间质增厚、肺泡腔有渗出，肺泡壁明显水肿,可见大量炎性细胞浸润，偶见分叶明显的中性粒细胞。乳铁蛋白组亦均有不同程度的肺组织损伤，但较M组肺组织损伤减轻，其肺泡组织结构相对完整，肺间质和肺泡腔内渗出物较M组明显减少，炎性细胞浸润现象亦减轻。与BLF2组相比，BLF1组的组织损伤更重一些。
2.小鼠BALF细胞因子测定：MALP-2所致的小鼠肺损伤模型BALF中IL-6、IFN-γ的水平在各组间存在明显差异。与NS组BALF中IL-6(64.65±4.80)、IFN-γ(162.25±41.14)水平相比，M组IL-6(431.17±110.3)、IFN-γ(1336.75±338.90)水平均显著增高(P＜0.05)。与M组BALF中IL-6(431.17±110.39)、IFN-γ(1336.75±338.90)水平相比，BLF2组IL-6(74.03±25.04)、IFN-γ(142.42±20.05)水平均显著减低(P＜0.05)；BLF1组IL-6(315.07±101.39)、IFN-γ(254.53±35.29)亦均明显减低(P＜0.05)。各组BALF中IL-4的水平无显著差异(P＞0.05)。
3.各组TLR2与NF-κBp65的表达情况
WB检测MALP-2致小鼠急性肺损伤模型BLF组与M组肺组织中NF-κBp65与TLR2蛋白水平存在显著差异。与M组相比，TLR2/β-actin的比值在BLF2组(0.19±0.05vs0.88±0.16，P=0.000)、BLF1组(0.64±0.06vs0.88±0.16，P=0.01)均显著减低；与BLF1组相比，BLF2组TLR2/β-actin的比值(0.19±0.05vs0.64±0.06,P=0.000)也显著减低。与M组相比，NF-κBp65/β-actin的比值在BLF2组(0.36±0.24vs0.87±0.21P=0.007)显著减低；在BLF1组(0.62±0.15vs0.87±0.21，P=0.114)也有减低趋势，但差异无统计学意义；BLF2组与BLF1组相比(0.36±0.24vs0.62±0.15,P=0.110)有减低趋势，但差异无统计学意义。
小结：牛乳铁蛋白可减轻MALP-2所致的小鼠急性肺损伤，降低BALF中IL-6、IFN-γ的水平，其作用机制可能与抑制TLR2/NF-κB炎症通路有关。
结论：
1.儿童MPP伴气道阻塞，表现为黏液栓或支气管塑型，阻塞的部位在段以下的支气管，女孩多见，可采用支气管肺泡灌洗联合细胞刷或异物钳清理气道，无严重并发症。气道阻塞患儿炎症指标水平更高，更容易形成难治性MPP,更多的患儿接受了糖皮质激素的治疗。气道阻塞形成的原因可能与局部MP的载量有关。
2.与非气道阻塞患儿相比，MPP伴气道阻塞患儿BALF中IL-6、TNF-α、IFN-γ的水平升高，IFN-γ/IL-4比值明显增高，感染局部可能存在更为严重的Th1/Th2细胞免疫失衡。
3.牛乳铁蛋白可减轻支原体膜脂蛋白MALP-2所致的小鼠急性肺损伤，降低BALF中IL-6、IFN-γ的水平。其作用机制可能与抑制TLR2/NF-κB炎症通路有关。