【摘 要】
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背景阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis,T.vaginalis）作为一种兼性厌氧寄生原虫,以性传播为主,常寄生于女性的阴道和男性的尿道、前列腺、睾丸、附睾及包皮下组织。其感染人后引起阴道毛滴虫病,该病在世界范围内广泛流行。阴道毛滴虫作为胞外寄生原虫黏附至寄生部位后,其多形性伪足穿行与包绕及鞭毛运动等机械作用,释放水解酶的消化作用和吞噬作用以及细胞脱落因子等综合因素,可直接损伤寄
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背景阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis,T.vaginalis）作为一种兼性厌氧寄生原虫,以性传播为主,常寄生于女性的阴道和男性的尿道、前列腺、睾丸、附睾及包皮下组织。其感染人后引起阴道毛滴虫病,该病在世界范围内广泛流行。阴道毛滴虫作为胞外寄生原虫黏附至寄生部位后,其多形性伪足穿行与包绕及鞭毛运动等机械作用,释放水解酶的消化作用和吞噬作用以及细胞脱落因子等综合因素,可直接损伤寄生部位的上皮细胞,继而引起组织器官炎症。因此,黏附于宿主细胞表面是阴道毛滴虫寄生和致病的关键性环节。阴道毛滴虫黏附蛋白65（TvAP65）作为滴虫的主要黏附蛋白之一,在黏附宿主细胞的过程中发挥重要作用,但其在阴道毛滴虫感染中的致病机制尚不明确。目的明确TvAP65在阴道毛滴虫感染宿主细胞过程中的致病作用,评估TvAP65作为疫苗候选抗原起到抗阴道毛滴虫感染的可能性,为临床滴虫病的干预提供理论依据。方法1.克隆TvAP65基因,构建原核表达载体,表达、纯化重组TvAP65蛋白,免疫大鼠制备TvAP65的多克隆抗体。2.采用免疫印迹法分析重组TvAP65蛋白（r TvAP65）的免疫原性和天然TvAP65分子的大小。3.采用免疫荧光法分析TvAP65在阴道毛滴虫滋养体中的定位以及重组TvAP65蛋白与人阴道上皮细胞（VK2/E6E7）的结合。4.采用脂质体转染及免疫荧光法优化si RNA转染阴道毛滴虫的条件;采用RNA干扰技术敲低TvAP65在阴道毛滴虫滋养体中的表达;筛选用于q PCR检测TvAP65m RNA水平变化的引物;q PCR和Western blot检测TvAP65的m RNA和蛋白水平,确认成功敲低TvAP65在阴道毛滴虫中表达。5.荧光探针标记阴道毛滴虫后体外感染VK2/E6E7细胞,在荧光显微镜下对黏附于VK2/E6E7细胞的滋养体进行计数,分析TvAP65蛋白分子在阴道毛滴虫黏附宿主细胞中的作用。6.分别采用MTT实验和流式细胞技术、台盼蓝染色分析敲低TvAP65表达后阴道毛滴虫对VK2/E6E7细胞的增殖、凋亡和死亡的影响。7.采用TvAP65重组蛋白主动免疫小鼠、TvAP65多克隆抗体被动免疫小鼠后分别腹腔感染阴道毛滴虫滋养体,以及TvAP65多克隆抗体封闭阴道毛滴虫滋养体后腹腔感染小鼠,观察小鼠的存活时间,分析TvAP65蛋白分子被阻断或封闭后滋养体在感染小鼠中的致病力,评价TvAP65作为疫苗候选抗原的可能性。结果1.核酸凝胶电泳结果显示,成功扩增TvAP65基因,并构建原核表达载体p ET-32a-TvAP65。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,获得大量纯净的r TvAP65蛋白,并制备了高滴度的抗TvAP65多克隆抗体。2.免疫印迹结果表明r TvAP65蛋白具有较好的免疫原性,能被感染阴道毛滴虫的小鼠血清识别。3.免疫荧光分析结果显示,TvAP65蛋白主要定位于阴道毛滴虫滋养体的表面,并且TvAP65蛋白能够与VK2/E6E7细胞结合。4.脂质体转染si RNA至阴道毛滴虫滋养体的最佳时长为24 h、最佳浓度为200nmol;筛选到用于q PCR检测TvAP65 m RNA水平的引物;根据优化好的条件进行si RNA干扰TvAP65的表达,q PCR和Western blot结果表明成功敲低阴道毛滴虫滋养体中TvAP65的m RNA和蛋白水平。5.敲低阴道毛滴虫TvAP65的表达后,滋养体黏附VK2/E6E7细胞的数量显著下降（P＜0.001）。6.VK2/E6E7细胞增殖、细胞凋亡和细胞活性实验结果分别表明,敲低阴道毛滴虫TvAP65的表达后,滋养体抑制VK2/E6E7增殖的作用显著减弱、诱导VK2/E6E7细胞凋亡和死亡明显降低（P＜0.001）。7.动物实验结果指出,与对照组小鼠相比,r TvAP65主动免疫的小鼠及TvAP65抗体阻断或封闭的小鼠腹腔感染阴道毛滴虫后生存时间明显增加（P＜0.01）。结论1.TvAP65作为阴道毛滴虫滋养体表面的黏附蛋白之一,主要定位于滋养体表面,并且可以与宿主细胞结合。2.敲低TvAP65表达能够降低阴道毛滴虫黏附宿主细胞数量,减弱滋养体抑制宿主细胞增殖、诱导宿主细胞凋亡和死亡的能力。3.动物实验指出阻断或封闭TvAP65后滋养体的致病力降低,TvAP65有可能作为抗阴道毛滴虫感染的疫苗候选抗原。
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