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肿瘤组织中的肿瘤细胞并不是均一的群体,其中存在一小部分细胞,这一小部分的细胞具有自我更新并产生异质性肿瘤的能力,表现出干细胞样特性,被称为肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)[1]。肿瘤干细胞的发现为阐明肿瘤的复发、转移和耐药提供了理论依据[2]。许多研究提示肿瘤干细胞可能是肿瘤发生、复发、转移和耐药的根源,探索肿瘤干细胞的作用和调控机制,有望为开发靶向肿瘤干细胞的新的治疗手段奠定基础。微小RNA(micoRNA,miRNA)是一类非编码的小分子RNA,长度约为19-22个核苷酸的小分子[3]。miRNA由具有发夹结构的大小约为70-90nt的单链前体经过Dicer酶进行剪切加工生成,其通过与靶基因的3’非编码区(3’untranslate region,3’UTR)碱性互补配对相结合,可以特异性抑制或降解靶基因的mRNA,进而抑制靶基因的翻译,调节靶基因的表达[3,4]。越来越多的证据表明,micoRNA在许多肿瘤中表达异常,能够参与肿瘤的形成、生长、转移、复发和耐药等,其中一些miRNAs与肝癌干细胞特性维持有着密切的联系[5,6]。因此,寻找在肝癌干细胞和肝癌非干细胞中差异表达显著的miRNA,无疑具有重要意义。本课题研究思路为:首先,筛选肝癌干细胞中表达显著下调的miRNA,在此基础上获得可能在肝癌干细胞维持中发挥重要作用的候选miRNA,进一步研究验证候选miRNA对肿瘤干细胞的生物学作用的影响并明确其发挥作用的靶基因。研究包括四个部分的内容:第一部分:通过The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库,比较肝癌组织与癌旁组织中miRNAs的表达情况,筛选在肝癌组织中表达下调的mirnas。结果显示,59个mirnas在肝癌组织中表达下调显著。进一步,我们通过成球实验(tumorsphere)体外富集肝癌干细胞,并利用荧光定量pcr技术进行筛选验证候选mirnas在贴壁细胞和成球干细胞(huh7和plc)中的表达情况,意图寻找在肝癌干细胞中显著下调的mirna。结果显示mir-99a、mir-10a、mir-486、mir-195、mir-154和mir-138表达下调明显。利用流式细胞术分选cd13阳性和阴性细胞、epcam阳性和阴性细胞,进一步筛选在cd13和epcam双阳性细胞中均表达下调显著的mirna,结果显示mir-486-5p在cd13+epcam+细胞中下调显著。该部分研究结果表明:mir-486-5p在肝癌组织和肝癌干细胞中下调显著。有研究表明mir-486-5p作为抑癌基因,在某些肿瘤中发挥作用,例如肺癌、胃癌等[7,8]。但是mir-486-5p在肝癌发生发展中的生物学作用,尤其是其对肝癌干细胞的作用未见报道,因此,在第二部分工作中,我们开展mir-486-5p对肝癌细胞以及肝癌干细胞生物学作用的研究。第二部分:我们利用慢病毒包装系统,获得mir-486-5p过表达的毒液上清,攻击肝癌细胞,建立稳定过表达mir-486-5p的肝癌细胞系;利用成球实验(tumorsphere)、侵袭实验、划痕实验、cck8细胞耐药实验及裸鼠皮下成瘤实验,探究mir-486-5p对肝癌干细胞的成球、侵袭、迁移、耐药和成瘤能力的影响;利用荧光定量pcr技术和流式细胞术,探究mir-486-5p对肝癌干细胞干性基因及干性表面标志物的影响。结果显示,mir-486-5p可以体外抑制肝癌干细胞的增殖、侵袭迁移、耐药、干性基因和标志物的表达,体内抑制肝癌细胞的成瘤能力。第三部分:为了进一步探讨mir-486-5p对肝癌干细胞的作用机制,我们利用生物信息学在线网站targetscan、pictar和microrna.org预测mir-486-5p的靶基因,从肿瘤、增殖、转移和干性四方面筛选mir-486-5p的候选靶基因;荧光定量pcr技术验证在mir-486-5p过表达或干涉的肝癌细胞和成球干细胞中其候选靶基因的表达情况;利用免疫组化和qrt-pcr技术,进一步验证在肝癌组织中miR-486-5p与靶基因的关系;最后利用双荧光素酶报告实验,明确miR-486-5p的靶基因。结果显示,在转录水平和翻译水平,SIRT1与mi R-486-5p的表达呈负相关关系;根据mi R-486-5p与SIRT1 3’UTR的结合情况,证明SIRT1是miR-486-5p的靶基因之一。第四部分:我们利用RNA干扰技术(RNAi),构建SIRT1的慢病毒干涉载体;利用慢病毒包装系统,构建稳定低表达SIRT1的肝癌细胞系;通过成球实验、平板克隆实验、CCK8细胞增殖实验、耐药实验及裸鼠皮下成瘤实验,探究SIRT1对肝癌干细胞的增殖和耐药的影响。结果显示,我们成功构建SIRT1慢病毒干涉载体,获得稳定低表达SIRT1的肝癌细胞系,并证明SIRT1促进肝癌细胞和肝癌干细胞的增殖、耐药和成瘤能力。综上,我们的工作首先证实了miR-486-5p可抑制肝癌干细胞的增殖、干性特征、侵袭、迁移、耐药和体内成瘤能力。其次,揭示了miR-486-5p对肝癌干细胞的作用是通过调控SIRT1的表达来实现的。该研究的意义在于:人工合成的miRNA与小分子化合物的功能相似,可以用于疾病的治疗。同时mi RNA可以被作为诊断肿瘤的生物标志物或治疗靶点。mi R-486-5p有望作为一个新的靶向肝癌干细胞的miRNA,为肝癌的临床诊断、预防及治疗提供新策略和新思路。