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慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)是临床上一种具有气流受限特征的常见疾病,且其气流受限具有不完全可逆性,且呈现进行性发展的特征[1]。炎症反应是其重要的病理特征,因此展开对气道炎症反应的研究,对于阐明其发病机制尤为重要。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是细菌内毒素的主要成分,可以刺激组织细胞,通过释放出多种炎性物质(包括细胞因子等),诱导炎症反应[2]。炎症反应涉及到多种细胞和多个信号通路。其中巨噬细胞起到极为重要的作用,而各信号通路组成的分子网络系统对于其调节起到核心作用[3]。通过阻抑这些信号通路能够抑制COPD炎症反应,从而起到治疗的作用。本文通过研究LPS诱导人单核细胞系(THP-1细胞)分泌炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1),及对信号通路核因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)、Janus激酶/信号转导-转录活化因子(JAK/STAT)、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)、过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)的激活情况,优化LPS诱导THP-1细胞体外炎症模型,研究调补肺肾三法(补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方)对其IL-8、TNF-α,MMP-9分泌情况及对转录因子NF-κB、信号转导-转录活化因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)的活性的影响。目的观察LPS诱导THP-1细胞炎症模型的炎症因子及NF-κB、JAK/STAT、MAPK、PPAR信号通路中NF-κB、STAT3、核转录因子激活蛋白AP-1(Nuclear factor activatorprotein-1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)活性的变化,筛选其靶通路,研究调补肺肾三法(补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方)对THP-1细胞NF-κB、STAT3转录因子的调控作用,以期为揭示调补肺肾三法方药抑制COPD炎症反应的分子作用机制及其特点提供依据。方法1.优化LPS诱导THP-1细胞炎症模型阿尔玛蓝法测定LPS对THP-1细胞生长的影响,分2组。不同浓度LPS(2.5μg/m L、5μg/m L、10μg/m L、20μg/m L、40μg/m L)不同时间(6h、12h、24h、48h)对THP-1细胞生长的影响;不同浓度LPS(0.125μg/m L、0.25μg/m L、0.5μg/m L、1μg/m L、2μg/m L)作用48h对THP-1细胞生长的影响。通过ELISA法检测1μg/m L、2μg/m L LPS在上述不同时间点作用后细胞上清中IL-6、IL-10、IL-8、TNF-α、MMP-9、TIMP-1等细胞因子的分泌情况,筛选出LPS最佳浓度及最佳作用时间。凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)法检测1μg/m L LPS作用于THP-1细胞24h后转录因子(NF-κB、AP-1、PPARγ、STAT3)活化情况。2.含药血清的制备日本大耳白兔96只,随机分为:正常对照组、补肺益肾方组、补肺健脾方组、益气滋肾方组,分别灌喂给予生理盐水、补肺益肾方药、补肺健脾方药、益气滋肾方药,每日2次,于最7次给药后1h,通过腹主动脉采血,离心分离血清,过滤分装,56℃、30min灭活后-70℃保存备用。3.观察调补肺肾三法方药对转录因子NF-κB、STAT3表达的影响根据以上模型优化结果,分组干预细胞:空白血清组、模型组、补肺益肾组、补肺健脾组、益气滋肾组。每组血清分为20%、40%两个浓度,ELISA法检测细胞因子IL-8、TNF-α、MMP-9。对于NF-κB信号通路,添加抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)组;对于JAK-STAT信号通路,添加抑制剂stattic组,EMSA法检测转录因子NF-κB、STAT3的活性。结果1.LPS诱导THP-1细胞炎症模型1.1 LPS对THP-1细胞生长的影响阿尔玛蓝法测定LPS对THP-1细胞生长的影响。10μg/m L LPS诱导6h还原率降低(p<0.05),2.5-40μg/m L各浓度LPS诱导12h、24h、48h还原率降低(p<0.05)。10μg/m L LPS在6h时及2.5-40μg/m L各浓度LPS在12h、24h、48h可使细胞质回缩,不饱满,细胞体积偏小,长势较慢。0.125-2μg/m L LPS作用48h对THP-1生长的影响无统计学意义。1.2 LPS对THP-1细胞分泌细胞因子IL-6、IL-10、IL-8、TNF-α、MMP-9、TIMP-1的影响ELISA法检测1μg/m L、2μg/m L LPS作用THP-1细胞不同时间点(6h、12h、24h、48h)对细胞因子水平的影响。对于IL-6的影响:与正常对照组比较,1μg/m L、2μg/m L LPS在各个时间点IL-6分泌增多(p<0.01);与12h同浓度的LPS比较,1μg/m L、2μg/m L LPS在24h、48h时分泌IL-6增多(p<0.01);2μg/m L组比1μg/m L组在24h、48h时分泌IL-6减少(p<0.01)。对于IL-8的影响:与正常对照组比较,1μg/m L、2μg/m L LPS在12h时IL-8分泌减少(p<0.05),在24h、48h时IL-8分泌增多(p<0.05,p<0.01);2μg/m L组在48h时比1μg/m L组时分泌IL-8增多(p<0.05)。对于TNF-a的影响:与正常对照组比较,1μg/m L LPS在6h、48h时TNF-a分泌增多(p<0.01),2μg/m L LPS在6h、12h、48h时TNF-a分泌增多(p<0.01);2μg/m L组比1μg/m L组在6h、12h、48h时分泌TNF-a增多(p<0.01)。对于IL-10的影响:与正常对照组比较,1μg/m L LPS在6h时IL-10分泌增多(p<0.05),在24h IL-10分泌减少(p<0.05),2μg/m L LPS在各个时间点对IL-10的影响无统计学差异;2μg/m L组比1μg/m L组在6h、24h分泌IL-10减少(p<0.05)。对于MMP-9的影响:与正常对照组比较,2μg/m L LPS在6h、48h时MMP-9分泌增多(p<0.01);2μg/m L组比1μg/m L组在6h、48h分泌MMP-9增多(p<0.01)。对于TIMP-1的影响:与正常对照组比较,1μg/m L LPS在6h、48h时TIMP-1分泌减少(p<0.01),在12h时TIMP-1分泌增多(p<0.05),2μg/m L LPS在6h、12h TIMP-1分泌增多(p<0.01,p<0.05),在24h、48h TIMP-1分泌减少(p<0.01);2μg/m L组比1μg/m L组在6h时TIMP-1分泌增多(p<0.01),在24h TIMP-1分泌减少(p<0.01)。1.3 LPS对THP-1细胞转录因子NF-κB、STAT3、AP-1、PPARγ表达的影响EMSA法检测1μg/m L LPS诱导THP-1细胞24h对转录因子NF-κB、STAT3、AP-1、PPARγ活性的影响。与正常对照组比较,1?g/m L LPS组NF-кB、STAT3探针结合程度增多(p<0.01);与正常对照组比较,1?g/m L LPS组对AP-1、PPARγ探针结合程度的变化无统计学意义。2.THP-1细胞中NF-кB、STAT3调控的调补肺肾三法含药血清对炎症反应机制的影响2.1调补肺肾三法不同浓度含药血清对THP-1细胞生长的影响通过阿尔玛蓝法测定不同浓度含药血清对于THP-1细胞生长的影响。与20%空白血清组比较,20%补肺益肾组还原率明显增高(p<0.05),20%补肺健脾组、益气滋肾组还原率明显增高(p<0.01);与20%模型组比较,20%补肺健脾组、20%益气滋肾组还原率明显增高(p<0.01);与40%模型组比较,40%补肺健脾组还原率明显降低(p<0.05),余浓度含药血清还原率无明显统计学意义。2.2调补肺肾三法含药血清对THP-1细胞分泌IL-8、TNF-?、MMP-9的影响ELISA法检测调补肺肾三法(补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方)20%及40%含药血清对THP-1细胞分泌IL-8、TNF-?、MMP-9的影响。与20%空白血清组比较,20%模型组MMP-9、TNF-?分泌增多(p<0.01,p<0.05),20%100mmol/L stattic组MMP-9、IL-8的分泌减少(p<0.01),20%100mmol/L PD TC组IL-8分泌减少(p<0.01);与20%模型组比较,20%100mmol/L stattic组MMP-9、IL-8、TNF-?分泌减少(p<0.01),20%100mmol/L PDTC组IL-8分泌减少(p<0.01)。20%调补肺肾三法方药对MMP-9、TNF-?的分泌有减少的趋势,但没有明显的统计学差异。与40%空白血清组比较,40%模型组MMP-9、IL-8、TNF-?分泌增多(p<0.01),40%益气滋肾组TNF-?分泌减少(p<0.01),40%100mmol/L stattic组、40%100m mol/L PDTC组MMP-9、IL-8分泌减少(p<0.01),TNF-?的分泌减少(p<0.05);与40%模型组比较,40%含药血清(补肺健脾、补肺益肾、益气滋肾)MMP-9分泌减少(p<0.05),IL-8、TNF-?的分泌减少(p<0.01),100mmol/L stattic组、100mmol/L PDTC组MMP-9、IL-8分泌减少(p<0.01),TNF-?的分泌减少(p<0.05)。2.3调补肺肾三法含药血清药及抑制剂对THP-1细胞NF-кB、STAT3转录因子活性的影响EMSA法检测调补肺肾三法方药及抑制剂,20%、40%浓度含药血清各组对NF-кB、STAT3活性的影响。对于转录因子NF-кB的活性:与40%空白血清组比较,40%模型组与NF-кB探针结合程度增多(p<0.01);与40%模型组比较,40%调补肺肾三法(补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方)及抑制剂PDTC组与NF-кB探针结合程度减少(p<0.01);与20%空白血清组比较,20%调补肺肾三法含药血清与NF-кB探针结合程度有增多的趋势,但无明显统计学意义;与20%模型组比较,亦无明显统计学意义。对于转录因子STAT3的活性:与40%空白血清组比较,40%模型组与STAT3探针结合程度增多(p<0.01);与40%模型组比较,40%调补肺肾三法含药血清组及抑制剂stattic组与STAT3探针结合程度减少(p<0.01);与20%空白血清组比较,20%模型组与STAT3探针结合程度有增多的趋势,但无明显统计学意义;与20%模型组比较,20%调补肺肾三法含药血清组及抑制剂stattic组无明显统计学意义。结论1.1μg/m L LPS作用THP-1细胞24h能激活NF-кB、JAK-STAT通路的活性。优化细胞炎症模型的条件,选用1?g/m L诱导THP-1细胞24h来建立炎症模型是适宜的。2.调补肺肾三法(补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方)均能下调模型组细胞分泌炎症因子IL-8、TNF-?、MMP-9的水平,抑制NF-κB、STAT3转录因子的活性。