聚-γ-谷氨酸是一种由D-谷氨酸和L-谷氨酸为单体以γ-羧基与α-氨基以肽键的形式缩合而成的一种聚阴离子类多肽分子,在医药、食品和农业等领域具有广泛的应用前景。 本论文采用枯草芽孢杆菌发酵制备聚γ-谷氨酸。从出发菌株筛选鉴定高产菌株,通过对摇瓶培养条件和发酵罐培养条件优化提高了聚γ-谷氨酸的产量,建立了发酵动力学模型,并开发了产物分离纯化的整套工艺。在此基础上,研究了枯草芽孢杆菌与谷氨酸棒杆菌混合培养的新工艺和采用味精生产的中间产物作为谷氨酸前体等方法降低聚γ-谷氨酸生产成本。同时,通过PCR的方法,将克隆得到的pgsBCA基因在大肠杆菌JM109中进行表达,最终得到了具有聚γ-谷氨酸生产能力的重组菌E.coli JM109/pTrc99a- pgsBCA。 从自然界筛选得到了一株聚γ-谷氨酸高产菌株,通过16s rDNA测序后BLAST以及生理生化性质,确定该菌株为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis ZJU-7,保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCC No.1250。 进行了Bacillus subtilis ZJU-7的培养条件优化及放大工作。通过对摇瓶的培养条件优化,得到了如下优化的培养基成分为:蔗糖59.80g/L,蛋白胨53.54g/L,,L-谷氨酸81.05g/L,NaCl 10g/L,MgSO₄·7H₂O 1.0g/L,CaCl₂ 1.0g/L;优化的培养条件为:培养温度,37℃,摇床转速,200rpm。在上述条件下,经过24～32小时发酵,最终聚γ-谷氨酸的产量为58.3g/L。在此基础上,将培养体系由摇瓶放大到5升发酵罐,聚γ-谷氨酸产量达到了51.7g/L。 开展了将谷氨酸棒杆菌发酵生产谷氨酸和枯草芽孢杆菌聚合生产聚γ-谷氨酸耦联发酵的研究。对影响混合培养的因素如种龄、混合比例、温度、溶氧等进行了优化,在优化的培养条件下,不需添加L-谷氨酸,聚γ-谷氨酸的产量达到了32.8g/L。 采用三种味精生产的中间产物作为谷氨酸替代前体,研究了蔗糖、胰蛋白胨和谷氨酸含量对聚γ-谷氨酸产量的影响。在优化后培养基中进行发酵生产,最终聚γ-谷氨酸酸产量为52g/L。 从Bacillus subtilis ZJU-7中克隆得到了pgsBCA基因,构建了表达载体pTrc99a-pgsBCA,并在大肠杆菌JM109进行表达,最终得到了具有聚γ-谷氨酸生产能力的重组菌E.coli JM109/pTrc99a-pgsBCA。