研究背景:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二大常见的与年龄相关的神经退行性疾病,是进行性发展的致死性复杂疾病。PD的病因学是多因素的,但是长期以来无论是家族性还是散发性PD,线粒体功能障碍一直被认为是PD发病最为重要的因素。鱼藤酮(rotenone)是一种从鱼藤及多种植物的根部提取的天然化合物,一直被视为安全有效的杀虫剂。大量的流行病学资料调查表明,长期慢性暴露于农药鱼藤酮的人群其PD的发病率高于普通人群。动物实验结果也提示长期接触鱼藤酮等线粒体复合物I抑制剂,可出现包括黑质纹状体多巴胺(dopamine,DA)神经元减少等类PD样病理学及行为学改变。我们前期的动物实验研究结果也显示大鼠长期慢性注射鱼藤酮可以诱导类PD病,体内和体外模型实验表明鱼藤酮可诱导神经元细胞中多巴胺分布和代谢的异常,促使神经元内发生氧化应激反应,导致线粒体功能障碍和细胞死亡。前期的研究也提示线粒体在鱼藤酮所致的多巴胺神经元变性损伤中发挥了核心作用,线粒体的动力学障碍可能参与了鱼藤酮诱导的多巴胺神经元的变性损伤和PD的病程。调控线粒体动力学平衡,维持线粒体的稳态有可能是农药鱼藤酮所致多巴胺神经元变性损伤最重要的保护措施之一。因此,本课题通过建立鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤体内和体外类PD病模型,探讨多巴胺神经元线粒体分裂/融合、线粒体自噬、线粒体生物发生和线粒体ATP敏感性钾通道在鱼藤酮致多巴胺神经元变性损伤过程中的作用及机制,以期为人类帕金森病的治疗提供新的思路和方向。研究内容:1.线粒体生物发生及线粒体分裂融合在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤中的作用和机制研究建立鱼藤酮诱导的高分化PC12细胞体外染毒模型,使用细胞毒性检测试剂盒来评价鱼藤酮对PC12细胞的毒性效应,并在透射电子显微镜下观察分析鱼藤酮对线粒体形态学、线粒体的长度和嵴的数量的影响;利用荧光探针标记线粒体并在激光共聚焦显微11镜下观察线粒体的片段化及分析线粒体数量和质量的改变;同时,使用TMRM染料检测PC12细胞线粒体膜电位的改变。利用荧光实时定量PCR检测多巴胺神经元线粒体拷贝数;采用RT-PCR检测线粒体生物发生相关因子PGC-1α和mt TFA,线粒体融合相关因子MFN2和OPA1,和线粒体分裂相关因子Drp1和Fis1基因转录水平的表达变化;WB实验检测酪氨酸羟化酶(TH)及线粒体生物发生和分裂/融合相关蛋白的表达变化;分别使用线粒体融合促进剂M1和线粒体分裂抑制剂Mdivi-1确定线粒体分裂/融合在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤中的作用;通过免疫荧光实验确定磷酸化Drp1蛋白的表达及其线粒体的转位作用。另外,通过si RNA转染和慢病毒感染构建低表达和过表达PGC-1α基因的PC12细胞模型,确定PGC-1α在多巴胺神经元线粒体生物发生和分裂/融合中的调控作用。2.PINK1/Parkin在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤中的作用及机制研究通过检测LC3-GFP荧光强度以及WB实验检测LC3和p62蛋白的表达水平观察鱼藤酮染毒神经元后细胞自噬的发生。同时,WB实验进一步检测了PINK1和Parkin及其磷酸化蛋白分别在PC12细胞及线粒体中的表达变化。利用LC3自噬腺病毒Ad-GFP-LC3与线粒体荧光探针Mito-tracker Red染色共定位情况以及线粒体荧光探针Mito-tracker Green与溶酶体荧光探针Lyso-tracker Red共染色两种方法在激光共聚焦显微镜下观察分析PC12细胞的线粒体自噬水平。分别采用si RNA转染和慢病毒感染构建低表达和过表达PINK1基因PC12细胞模型,检测线粒体DNA拷贝数,PGC-1α和mt TFA的蛋白表达以确定PINK1/Parkin通路对线粒体生物发生的作用;同时检测MFN2、OPA1、Drp1和Fis1的蛋白表达水平以确定PINK1/Parkin通路对线粒体分裂/融合的作用。另外,分别构建PGC-1α低表达和过表达细胞模型,检测PINK1、Parkin和p-Parkin的蛋白表达水平和线粒体的自噬水平以确定PGC-1α对PINK1/Parkin通路的调控作用。3.线粒体ATP敏感性钾通道在鱼藤酮诱导多巴胺神经元变性损伤中的作用及机制研究构建鱼藤酮诱导的SD大鼠类PD病模型和细胞模型,并在鱼藤酮染毒前分别给予线粒体ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪或抑制剂5-HD,评价线粒体ATP敏感性钾通道在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤中的作用。采取大鼠神经行为学实验(旷场试验,转棒式疲劳仪实验)和小动物核磁共振扫描观察大鼠中脑基底神经节结构和功能的变化,高效液相色谱法观察神经元多巴胺的释放分泌,以及WB和免疫组化实验检测多巴胺神经元的标志性蛋白酪氨酸羟化酶的表达,以进一步验证鱼藤酮诱导的大鼠类PD病模型的建立。在激光共聚焦显微镜和透射电子显微镜下观察分析多巴胺神经元线粒体质量,数量及形态的变化,高效液相色谱法分析ATP的含量,检测大鼠多巴胺神经元ROS水平和线粒体呼吸链复合物I的活性。RT-PCR和WB实验检测了多巴胺神经元中PGC-1α、mt TFA、MFN2、OPA1、Drp1和Fis1的m RNA及蛋白的表达水平变化。分离多巴胺神经元的线粒体蛋白和胞质蛋白后,WB分别检测了Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2A和SUR2B的蛋白表达。此外,通过si RNA转染构建Kir6.1低表达的PC12细胞模型,检测线粒体DNA损伤、线粒体片段化以及线粒体分裂融合的改变。4.二氮嗪在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元急性损伤及慢性损伤中的作用效应研究通过构建鱼藤酮急性损伤和慢性损伤动物模型,并在染毒前予以同剂量二氮嗪或5-HD预处理,分别检测SD大鼠的生存率,纹状体组织的ATP、DA含量,ROS水平,线粒体呼吸链复合物I的活性,以及血液中尿酸,血糖以及超敏C-反应蛋白的变化。研究结果:1.PGC-1α介导的线粒体生物发生与分裂/融合之间的交互作用参与调节了鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤作用建立了鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤细胞模型,结果显示:鱼藤酮可以导致多巴胺神经元细胞活性降低,TH蛋白的表达下调,分泌释放多巴胺的能力降低;线粒体膜电位降低,活性氧的生成增加等。透射电镜下可见大量的小圈状或点状的碎片化线粒体,同时线粒体的长度、面积以及线粒体嵴的长度明显减小,因此鱼藤酮可诱导多巴胺神经元线粒体形态结构和功能的异常,进而导致多巴胺神经元的变性损伤。同时,RT-PCR和WB实验结果显示,线粒体生物发生相关因子(PGC-1α和mt TFA)及线粒体融合分裂相关因子(MFN2、OPA1、Fis1)的基因转录和蛋白表达水平在鱼藤酮的作用下均出现不同程度的降低,而磷酸化Drp1蛋白却出现表达上升的趋势,与对照组比较具有显著性差异。进一步利用线粒体分裂抑制剂M1和融合促进剂Mdivi-1干预鱼藤酮染毒的多巴胺神经元,结果显示M1和Mdivi-1可以提高细胞活性、增加线粒体DNA拷贝数以及TH蛋白的表达,减少线粒体DNA的片段化,具有改善的线粒体质量和形态的作用。过表达PGC-1α可显著抑制鱼藤酮诱导的PC12细胞的死亡,提高线粒体质量和线粒体DNA拷贝数,升高了MFN2的蛋白表达并显著降低了p-Drp1的蛋白表达水平,因此,过表达PGC-1α对鱼藤酮诱导的多巴胺神经毒性有显著的保护作用。而低表达PGC-1α可加剧鱼藤酮诱导的PC12细胞的神经毒性作用,MFN2的蛋白表达水平显著下降,p-Drp1的蛋白表达水平显著上升。另外,免疫荧光实验的结果也进一步提示提示鱼藤酮可促使p-Drp1蛋白表达升高并从胞浆向线粒体转位。体自噬在鱼藤酮诱导的多巴胺神经变性损伤中的作用在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤的细胞模型中,LC3-2/LC3-1比例增加,p62的表达降低,提示鱼藤酮可诱导PC12细胞自噬。进一步的研究显示,鱼藤酮可以诱导多巴胺神经元PINK1/Parkin蛋白的表达水平升高,并促使PINK1/Parkin由细胞质向线粒体的转位,同时线粒体标记蛋白Mito-Tracker Red和自噬标记蛋白LC3-GFP共定位结果显示鱼藤酮可以诱导线粒体的自噬。进一步研究结果表明,PINK1、Parkin和p-Parkin的蛋白水平与PGC-1α的表达水平呈负相关;低表达PINK1能够上调PGC-1α及其靶基因mt TFA的蛋白水平,同时可显著增加线粒体DNA拷贝数。反之,过表达PINK1则导致PGC-1α及其靶基因mt TFA表达下调,线粒体DNA的拷贝数减少。因此,PINK1/Parkin通路与线粒体的生物发生有关,干预PINK1/Parkin通路可以调控线粒体的生物发生。同时研究发现PGC-1α的表达改变时,可以影响PINK1/Parkin蛋白的表达和线粒体的自噬水平。因此,PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬和PGC-1α介导的线粒体生物发生之间存在相互作用。进一步的实验结果显示,MFN2的蛋白表达与PINK1基因的表达水平呈负相关,而磷酸化Drp1蛋白的表达与PINK1基因则呈正相关。结合PGC-1α对MFN2和Drp1的调控作用,我们推测,MFN2和Drp1可能位于PINK1和PGC-1α蛋白的下游,PINK1和PGC-1α的相互拮抗调控着线粒体自噬,线粒体生物发生以及线粒体的分裂/融合作用,调控线粒体的质量和维持着线粒体稳态。3.线粒体ATP敏感性钾通道通过调控线粒体的质量参与了鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤我们建立了鱼藤酮诱导的类PD病的动物模型和细胞模型,研究mito KATP通道与线粒体的质量控制关系在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤中的作用。首先通过神经行为学实验、病理学实验、多巴胺神经元特异性标志蛋白TH的表达以及神经元释放分泌多巴胺的能力,证实鱼藤酮诱导的类PD损伤动物模型的建立。在二氮嗪预处理组中SD大鼠神经行为障碍及大脑基底神经节的结构异常比鱼藤酮染毒组更加严重,而5-HD预处理对鱼藤酮引起大鼠神经行为障碍及大脑基底神经节的结构异常具有显著的保护作用。进一步研究结果显示,mito KATP通道的开放剂二氮嗪会加重鱼藤酮的神经毒性,包括大鼠的生存率降低,ATP生成减少,线粒体复合物I活性和多巴胺的浓度降低,大鼠纹状体线粒体形态与超微结构异常,线粒体ROS蓄积,线粒体DNA拷贝数减少,线粒体片段化增加等,而mito KATP通道抑制剂5-HD阻断状态可逆转上述指标的改变,对鱼藤酮诱导的多巴胺能神经退行性性变具有显著的保护作用。进一步研究结果显示,体内和体外模型中mito KATP通道构成亚基蛋白都是2.PINK1/Parkin与PGC-1α相互作用调控的线粒体生物生成、分裂/融合以及线粒Kir6.1/SUR2B,而且鱼藤酮可以导致Kir6.1亚基的表达降低,对SUR2B亚基蛋白表达无显著性的作用。同时,低表达Kir6.1蛋白对鱼藤酮诱导的多巴胺神经毒性有显著的保护作用:细胞活性显著性提高,线粒体DNA拷贝数增加,线粒体片段化减少和改善线粒体质量。与此同时,沉默Kir6.1可以使线粒体生物发生相关因子PGC-1α和线粒体融合蛋白MFN2的蛋白表达水平表达升高,磷酸化Drp1的蛋白表达水平降低。因此,mito KATP通道构成亚基蛋白Kir6.1能够通过调节线粒体生物发生和线粒体分裂融合参与了鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤。4.二氮嗪在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元急性损伤和慢性损伤中的效应不同结合鱼藤酮诱导的类PD病慢性损伤动物模型的实验结果,我们进一步研究了二氮嗪在鱼藤酮诱导多巴胺神经元急性损伤中的作用。结果表明,二氮嗪对鱼藤酮诱导的SD大鼠急性损伤有明显的保护作用,二氮嗪预处理可以显著改善鱼藤酮引起的SD大鼠生存率降低、线粒体功能障碍以及大鼠血糖代谢紊乱等,而5-HD对鱼藤酮引起的急性损伤并无显著作用。研究结论:1.鱼藤酮长期的慢性暴露可以诱导大鼠出现类PD病的神经行为学与病理形态学的改变。2.鱼藤酮暴露可以引起多巴胺神经元线粒体生物发生障碍、线粒体分裂/融合失衡、线粒体自噬失调,进而导致多巴胺神经元线粒体质量、数量和功能的异常。3.一方面PGC-1α调控着线粒体的生物发生,另一方面PGC-1α又可以通过MFN2和p-Drp1影响多巴胺神经元线粒体分裂与融合的动态平衡;同时干预线粒体分裂与融合又可以影响PGC-1α和线粒体的生物发生;因此,PGC-1α通过调控线粒体生物发生与分裂/融合的交互作用在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元的变性损伤中发挥了重要作用。4.PINK1/Parkin通路参与了鱼藤酮诱导的多巴胺神经元线粒体的自噬;PINK1基因可以影响线粒体生物发生以及分裂、融合相关蛋白的表达,同时PGC-1α又可以反过来影响PINK1/Parkin通路蛋白的表达,因此,PINK1/Parkin通路和PGC-1α通过相互拮抗作用进一步调控多巴胺神经元线粒体生物发生,分裂/融合和自噬,控制线粒体的质量和维持线粒体的稳态,进而在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤中发挥了关键作用。5.mito KATP在多巴胺神经元中的组成亚基为Kir6.1/SUR2B,其通过调控线粒体的生物发生和分裂/融合作用的关键调控蛋白参与了鱼藤酮诱导的多巴胺神经元的变性损伤,Kir6.1亚基在该过程中发挥了主要作用。在鱼藤酮诱导的类PD病动物模型中开放mito KATP通道会加重鱼藤酮的神经毒性,而阻断mito KATP通道对鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤具有显著的保护作用。6.mito KATP通道开放剂二氮嗪对鱼藤酮诱导的急性损伤和慢性损伤的作用机制可能是完全不同的。在鱼藤酮诱导的急性损伤中,二氮嗪预处理对鱼藤酮导致的线粒体功能障和血糖代谢紊乱有显著的保护作用,而5-HD预处理对鱼藤酮的毒性损伤并无显著作用综上所述,鱼藤酮可以通过引起线粒体动力学失衡,包括生物发生、线粒体分裂/融合、线粒体自噬等导致线粒体的功能障碍,破坏线粒体稳态和质量,诱导多巴胺神经元的变性损伤。在此过程中,PGC-1α与PINK1/Parkin通路通过相互拮抗作用对多巴胺神经元线粒体生物发生,分裂/融合和自噬进行交互调控,进而维持线粒体的稳态和质量;另外,线粒体ATP敏感性钾通道在多巴胺神经元中的的组成亚基为Kir6.1/SUR2B,其关键的功能基团Kir6.1通过调控线粒体的生物发生和分裂/融合作用的关键调控蛋白,影响线粒体的质量控制,参与了鱼藤酮诱导的多巴胺神经元的变性损伤。