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本论文构筑了基于DNA和酶的层层组装薄膜和电活性指示剂的DNA电化学生物传感器,用循环伏安法(CV)检测由酶催化反应诱导的DNA现场氧化损伤和加合损伤,以及抗氧化物酶对DNA的保护作用。用石英晶体微天平(QCM)对DNA-酶层层组装薄膜的组装过程进行了监测。该DNA-酶传感器提供了一个简单的体外模型,有助于我们理解生命体内DNA的损伤和保护机理,也为化合物体外基因毒性筛查和预测化合物的潜在基因毒性提供了一个新的研究思路。
第一章前言
简述了DNA损伤的电化学检测的研究意义。介绍了DNA的结构和性质,以及各种因素引起的DNA损伤。简述了DNA损伤的电化学检测的研究进展、DNA的电化学性质、DNA在电极表面的固定方法等。对实验中用到的三种氧化还原酶的结构和功能也做了简要综述。
第二章层层组装薄膜中DNA现场Fenton损伤的电化学检测及catalase层对DNA的保护作用
将天然DNA和葡萄糖氧化酶(GOD)采用层层组装的方法固定到热解石墨(PG)电极表面。将此薄膜电极放入含有葡萄糖(glucose)和Fe2+的溶液中温浴,薄膜中的GOD在O2存在的条件下将催化氧化glucose并产生葡萄糖酸酯(gluconolactone)和H2O2,现场产生的H2O2立即和溶液中的Fe2+作用,发生典型的Fenton反应,产生的活性氧物质羟基自由基(·OH)能够损伤薄膜中的DNA。电活性指示剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+在电极上发生反应产生的Ru(bpy)3+可以对薄膜中DNA的鸟嘌呤产生催化氧化作用,据此可以灵敏地检测出现场Fenton反应引起的DNA损伤。在薄膜外层组装的过氧化氢酶catalase层可以保护DNA不受损伤,因为catalase可以有效地催化分解现场产生的H2O2。而且,只有当catalase层更接近GOD层时,其对DNA的保护效果最好。本章工作将DNA损伤的电化学检测、电活性指示剂Ru(bpy)32+的催化功能和层层组装技术相结合,以模拟真实生命体内DNA的氧化损伤和保护过程,为研究DNA损伤和保护提供了一个简单的体外模型。
第三章电化学方法检测HRP现场催化氧化苯乙烯引起的DNA损伤
生命体内的血红素过氧化物酶在H2O2的激活下可以将苯乙烯(styrene)代谢为环氧苯乙烯(SO),产生的SO能够造成DNA的加合损伤。本章选择辣根过氧化物酶HRP作为过氧化物酶的代表,在PG电极上构筑了DNA-HRP层层组装薄膜,作为检测DNA损伤的传感器。在GOD+glucose+styrene溶液体系中,葡萄糖氧化酶(GOD)可以催化氧化葡萄糖(glucose)并产生H2O2,而薄膜中的HRP在H2O2的作用下可以氧化styrene,所产生的SO可以造成DNA加合损伤,并被电活性指示剂Ru(bpy)32+所检测。该体系提供了一个由于酶的作用在体外现场产生基因毒性物质并损伤DNA的模型,模拟了生命体内具有潜在基因毒性的有机污染物经过代谢而造成DNA损伤的过程,为研究和筛查有机化合物的潜在基因毒性提供了新的思路。