论文部分内容阅读
由肠产毒素性大肠杆菌(ETEC)引起的仔猪腹泻是危害仔猪健康的重要疫病之一。由于抗生素禁用以及缺乏有效的商品化疫苗等原因，ETEC对我国及全球的生猪产业造成了巨大的经济损失。因此，从宿主固有的防御反应入手，找到有效可行的控制ETEC措施非常重要。白细胞介素(IL)-17通过促进IL-26的产生，单核细胞和中心粒细胞的聚集等机制调控肠道病原菌感染。前期研究表明，ETEC促进仔猪肠道IL-17的表达，然而其机制尚未清楚。本研究对ETEC促进肠道IL-17表达的机制进行研究，旨在为合理有效的利用IL-17通路调控ETEC感染提供必要的科学依据。利用ETEC感染的仔猪、小鼠（ICR和C57）以及细胞(T细胞)模型，采用宏基因组学、蛋白质组学(iTRAQ)、代谢组学(GC-MS)以及遗传修饰等技术，研究ETEC感染后肠道IL-17表达的机制。主要研究结果如下: 1) ETEC促进仔猪和小鼠空肠IL-17 mRNA的表达，且IL-17主要细胞来源于CD3+CD4+IL-17+(Th17)细胞:ETEC感染促进仔猪空肠IL-17 mRNA的表达(P＜0.05)和小鼠空肠IL-17 mRNA表达，增加(P＜0.05)小鼠空肠胞浆和核内RORγt（IL-17转录因子）的含量;流式分析发现ETEC增加(P＜0.05)了小鼠空肠CD3+IL-17+细胞的比例，特别是CD3+CD4+IL-17+细胞的比例;在Rag1缺失（没有成熟的B细胞和T细胞）小鼠上，ETEC对Rag1-/-小鼠空肠中IL-17mRNA的表达无显著影响，而ETEC感染的Rag1-/-小鼠空肠中IL-17 mRNA的水平显著(P＜0.05)低于ETEC感染的野生型小鼠;在TCRδ缺失小鼠（体内没有γ/δ T细胞）上，ETEC感染的野生型小鼠与ETEC感染的TCRδ-/-小鼠的空肠IL-17 mRNA的表达无显著差异。 2) ETEC通过mTORC1-S6K1-EGR-2-GFI-1通路促进肠道IL-17 mRNA的表达:蛋白质学和免疫印迹分析表明，ETEC促进空肠mTORC1通路的活化(P＜0.05)，而Rapamycin体内抑制mTORC1通路显著(P＜0.05)抑制小鼠空肠中IL-17 mRNA的表达:体外Th17分化试验也表明，Rapamycin处理后能显著(P＜0.05)抑制na(i)ve CD4+T细胞向Th17细胞分化;进一步研究表明，mTORC1通过S6K1-EGR-2-GFI-1通路调控ETEC感染小鼠肠道IL-17 mRNA的表达，而PF-4708671体内抑制S6K1则能抑制空肠中EGR-2-GFI-1通路的活化以及IL-17mRNA的表达。 3) ETEC感染提高空肠GABA浓度，从而激活mTORC1通路调控IL-17mRNA的表达: GC-MS分析发现，ETEC感染显著(P＜0.005)增加了空肠中GABA的浓度，且GABA能呈剂量依赖性的促进(P＜0.05) ETEC感染后空肠IL-17 mRNA的表达，而Rapamycin抑制mTORC1通路后，能显著(P＜0.05)抑制GABA对IL-17 mRNA表达的促进作用;GABA受体特异抑制剂（GABAA受体抑制剂Bicuculline和GABAB受体抑制剂CGP-35348）能抑制(P＜0.005)空肠中mTORC1-EGR-2通路的活化以及IL-17 mRNA的表达;同时GABA合成酶特异抑制剂（L-allyglycine和Semicarbazide）也能抑制(P＜0.01)空肠中mTORC1-EGR-2通路的活化以及IL-17 mRNA的表达;体外Th17分化试验表明，L-allyglycine或Semicarbazide能显著(P＜0.05)抑制na(i)ve CD4+T细胞向Th17细胞分化; GABA-mTORC1通路调控多种肠道病原体感染模型下或肠炎模型下IL-17 mRNA的表达。 4) ETEC感染导致仔猪肠道微生态失衡，增加Lactococcus lactis过量产生GABA而调控IL-17 mRNA的表达:肠道微生物分析发现，ETEC促进(P＜0.05)仔猪和小鼠空肠中Lactococcus lactis subsp.lactis的数量;口服Lactococcus lactissubsp.lactis显著(P＜0.05)促进仔猪和小鼠空肠IL-17 mRNA的表达，而GABA受体抑制剂CGP-35348抑制了(P＜0.05)其对IL-17 mRNA的调控作用;广谱抗生素处理减少小鼠空肠Lactococcus lactis subsp.lactis的数量，抑制(P＜0.05)ETEC感染小鼠空肠IL-17 mRNA的表达，而口服Lactococcus lactis subsp.lactis或GABA能恢复(P＜0.05)空肠IL-17 mRNA的表达;在无菌小鼠的模型下，口服Lactococcus lactis subsp.lactis显著(P＜0.05)促进ETEC感染空肠IL-17 mRNA的表达。 5)小鼠GAT-2敲除促进肠道感染时Th17反应:小鼠GAT-2敲除对小鼠T细胞在胸腺的发育、外周的动态以及空肠中细胞因子的表达没有显著的影响，而在C.rodentium和ETEC感染的模型下，GAT-2敲除减少小鼠肠道细菌定植(P＜0.05)，增加了Th17细胞的相对比例和绝对数量(P＜0.05)，且促进肠道IL-17mRNA的表达(P＜0.05);体外Th17分化试验也表明，GAT-2敲除小鼠的CD4+T细胞向Th17细胞分化的比例也显著高于野生型小鼠(P＜0.01)。 上述结果表明，ETEC促进仔猪和小鼠空肠IL-17 mRNA的表达，IL-17的主要细胞来源是CD3+CD4+IL-17+细胞。机制上，ETEC导致仔猪肠道微生态失衡，增加Lactococcus lactis的数量，从而过量产生GABA激活mTORC1-S6K1-EGR-2-GFI-1信号通路而调控IL-17 mRNA的表达。GAT-2敲除后促进ETEC感染小鼠肠道的Th17免疫应答反应，从而减少ETEC的定植。由此可见，IL-17可作为调控肠道ETEC感染的靶点，维持肠道L.lactis的数量或GABA的浓度可预防仔猪ETEC感染。