CRISPR/Cas是古生菌和细菌中的一种基于RNA引导的获得性免疫系统,能够赋予古生菌和细菌抵抗噬菌体入侵的能力。CRISPR/Cas系统能够对靶标DNA进行特定位点的识别与切割,因而广泛应用于基因编辑领域,为疾病治疗提供了一种极具潜力的发展方向。Cas12a（Cpf1）属于V型CRISPR/Cas系统,能够在单条RNA的引导下对特定序列的双链DNA进行识别与切割。随着相关研究的开展,Cas12a对单链DNA非特异性切割的附属切割活性被发现。以两端分别标记荧光基团和猝灭基团的短单链DNA作为信号报告分子,可以将附属切割活性以放大的荧光信号形式输出。因此,Cas12a既可以用于核酸识别,同时具有信号放大的功能,在生物传感领域引起了广泛的关注。结合等温核酸扩增技术,基于CRISPR/Cas的高灵敏度（a M）、高特异性（单碱基突变）的核酸生物传感方法如SHERLOCK、HOLMES和DETECTR等,已经开发出来并应用于传染病核酸检测。CRISPR/Cas系统在一定程度上革新了核酸分子诊断技术,其在非核酸分析物（如小分子和蛋白质）传感中的应用也同样值得关注,而相关研究仍处于起步阶段,因此开发基于CRISPR/Cas的非核酸生物传感平台具有重要意义。本文构建了基于CRISPR/Cas的生物传感新方法用于蛋白酶、T4 PNK激酶等非核酸分析物活性的检测,具体工作如下:1、响应蛋白酶活性的Acr-Cas12a元件的设计与构建。本节中,我们使用能够被TEV蛋白酶特异性识别的底物序列作为连接肽将LbCas12a及其抑制剂Acr VA4连接,得到Acr-Cas12a重组蛋白。在Acr-Cas12a中,连接肽使LbCas12a与Acr VA4形成了分子内复合物,LbCas12a核酸酶活性被抑制,处于失活状态,当连接肽被靶标蛋白酶切割后,分子内作用被破坏,LbCas12a恢复核酸酶活性,因此该元件能够通过LbCas12a的激活实现对蛋白酶活性的响应。本章主要对Acr-Cas12a的表达载体进行设计与克隆构建,经过蛋白表达与纯化得到重组蛋白,并对Acr-Cas12a蛋白的响应性能进行初步验证。具体流程如下:通过同源重组方法构建重组质粒,在大肠杆菌表达系统中进行蛋白表达,通过纯化与脱盐得到高纯度的Acr-Cas12a蛋白。同时通过酶切反应及Cas12a核酸水解反应验证了Acr-Cas12a元件对靶标的识别特异性和可激活性,为后续开发生物传感平台提供基础。2、构建基于Acr-Cas12a元件的蛋白酶高灵敏荧光传感平台。在靶蛋白酶存在时,Acr-Cas12a中的连接肽被切割,分子内抑制作用被破坏,从而激活LbCas12a的核酸酶活性。利用LbCas12a附属切割活性对荧光DNA报告子的切割,可以实现将蛋白酶活性转化为放大的荧光信号。本章以响应蛋白酶活性的Acr-Cas12a为工具蛋白,构建了一种检测蛋白酶活性的高灵敏荧光生物传感平台。对传感平台进行可行性探究和检测条件的优化。在优化的反应条件下,该传感平台对TEV蛋白酶的检测限低至0.66 p M,并对检测靶标具有良好的选择性。此外,由于Acr VA4和LbCas12a之间的连接肽可以进行重新设计,蛋白酶识别位点也可以进行替换,因此基于本传感方法可以拓展开发出检测不同蛋白酶的模块化、可编程的生物传感平台,具有较大的应用潜力。3、构建DNA连接反应触发的CRISPR/Cas12a传感平台用于检测T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）。带有缺口的靶标双链DNA丧失了激活LbCas12a附属切割活性的能力,DNA连接酶可以连接缺口,恢复激活LbCas12a附属切割活性。DNA连接酶只能连接5-PO4和3-OH形成磷酸二酯键,无法对5-OH和3-OH进行连接,通过T4 PNK对5-OH的磷酸化作用可以使得连接反应得以进行,因此T4 PNK可以通过DNA连接反应触发LbCas12a的附属切割活性。基于此原理,本章构建了一种基于DNA连接反应触发的CRISPR/Cas12a传感平台用于检测T4 PNK,并对传感系统进行可行性探究和检测元件优化。在优化条件下,该传感平台能够高灵敏（LOD=0.0005 U/m L）、高特异性地检测T4 PNK激酶活性。该方法可用于T4 PNK抑制剂的分析筛选,也能实现对Hela细胞中T4 PNK活性的分析,在疾病诊断方面具有应用潜力。