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虾青素(astaxanthin)是一种非维生素A源的酮类胡萝卜素,是迄今为止自然界中最强的天然抗氧化剂,具有较高的经济和应用价值。天然反式结构的游离态虾青素易于被人体吸收利用,但来源少产量低。同时,虾青素性质不稳定,水溶性较差,生物利用度较低等限制了其在功能性食品中的广泛应用。因此,选择合适的制剂技术拓宽虾青素在功能性食品中的应用显得尤为重要。红法夫酵母(Xanthopgyllomyces dendorhous)发酵生产的虾青素为反式结构且多为游离态,但其虾青素产量低,易受葡萄糖的代谢阻遏等限制了其工业化应用。因此,本研究利用氮掺杂碳点(nitrogen-doped carbon dots,N-CDs)提高钝顶螺旋藻中虾青素前体物质 的积累,并利用钝顶螺旋藻替代有机氮源和部分葡萄糖进行红法夫酵母发酵提高终产物虾青素的积累,进一步制备载虾青素微粒提高虾青素的稳定性及生物利用度,进而探究载虾青素微粒对氧化应激状态下的Caco-2细胞的抗氧化保护作用及其作用机制。研究结果如下:(1)利用N-CDs促进钝顶螺旋藻的生长并提高虾青素前体物质的积累。结果表明,牛血清白蛋白(BSA)经水热合反应制备的N-CDs具有良好的水分散性,且在可见光范围内发射较强蓝光。浓度1～40 mg/L范围内的N-CDs未对小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7产生任何毒性,为N-CDs的应用提供安全评价保障。与对照组相比,N-CDs有效促进了螺旋藻的生长和活性物质的积累。N-CDs添加到螺旋藻培养体系后的最佳培养条件为N-CDs添加浓度10 mg/L,培养温度26℃,光照强度4500 Lux,培养周期10天,限氮胁迫(NaNO3 1.25 g/L);在此培养条件下螺旋藻的生物量达到1.48g/L,β-胡萝卜素和玉米黄质达到1.20mg/g和0.43 mg/g,与原培养条件的螺旋藻相比,三者分别增加了 140.32%、96.72%和95.45%。(2)基于虾青素合成代谢途径,利用红法夫酵母发酵钝顶螺旋藻提高虾青素的积累。结果表明,红法夫酵母生物量与菌体浓度呈良好的线性关系。将螺旋藻替代有机氮源及部分葡萄糖后,红法夫酵母的生长稳定期延后且生物量增加。较低的pH(pH<5)不利于生物量的积累但促进虾青素的合成,且虾青素主要在红法夫酵母发酵的稳定期进行合成积累。通过随机质心映射优化法(RCO)优化得到红法夫酵母最大虾青素积累的发酵方案为螺旋藻粉浓度3.5 g/L,pH为5.5,发酵时间为104 h;此条件下的红法夫酵母的生物量和虾青素含量与标准培养相比分别提高了 33.60%和58.46%。红法夫酵母发酵螺旋藻与原标准红法夫酵母发酵相比,β-隐黄质、玉米黄质、角黄素和虾青素含量分别提高了 27.76%、359.66%、251.18%和60.14%;与螺旋藻相比,β-胡萝卜素、β-隐黄质和玉米黄质含量分别降低了 76.61%,76.96%和20.08%,表明螺旋藻的添加促进了红法夫酵母类胡萝卜素代谢向虾青素合成方向的发展,进而促进虾青素的积累。通过从红法夫酵母发酵螺旋藻冻干粉中进行虾青素提取、分离、纯化及重结晶,得到纯度为91.32%的虾青素样品。(3)制备不同载量的虾青素前体脂质体(AP)和虾青素聚合物脂质纳米粒(APLN)并进行表征分析。通过FE-SEM和TEM观察得到两种载虾青素微粒类似于球形,在水中具有良好的分散性,粒径分布及分散程度均匀,且粒子间存在较大的静电排斥力;其中载量为1%时的AP与APLN均表现出较高的包封率和有效载量,选择此载量微粒进行后续研究。固态特征分析(FTIR和DSC)表明虾青素在载体内分散的过程中彼此相互作用,包埋效果良好。贮存稳定性实验结果表明两种载虾青素微粒显著降低了虾青素的降解,且APLN在不同的贮存温度下的降解率更低,与AP相比分别降低了 2.96%(0℃)、2.09%(25℃)和5.22%(37℃)。体外胃肠模拟消化结果显示,两种载虾青素微粒的粒径均出现在先增大后降低的变化趋势,与测定的包封率的变化趋势一致,并且肠模拟阶段后AP和APLN的包封率急剧下降为32.97%和49.89%,表明虾青素在此阶段大规模释放。化学抗氧化活性测定结果显示,载虾青素微粒与未包埋的虾青素相比具有更强的DPPH自由基清除力和FRAP还原能力。(4)研究了载虾青素微粒对氧化应激状态下的Caco-2细胞的保护作用及作用机制。结果表明,虾青素(AST)作用浓度为2 μg/mL时,AST、AP和APLN以及两种空载体BP和BPLN作用Caco-2细胞24 h对Caco-2细胞的成活率和LDH漏出率无毒性损伤,可进行后续抗氧化保护作用的探究。两种载虾青素微粒可以提高氧化应激状态下的Caco-2细胞的成活率,降低LDH漏出率,抑制ROS过度生成和蛋白质羰基化产物的过度积累,增加胞内抗氧化剂(GSH)的含量,降低4种胞内关键抗氧化酶(SOD、CAT、GPx和GR)的活性,其主要作用机制是清除细胞中过多的ROS来缓解Caco-2细胞的氧化应激损伤,进而对细胞起到保护作用。