研究背景食管癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,在全球范围内,食管癌导致的死亡率高居第六位。全球数据统计结果提示,食管癌的分布具有明显的地区、地域、民族差异,在我国、南非、沙特阿拉伯等国发病率较高,高、低发区发病率相差高达500倍。在中国北方,河南省、山东省、河北省交界处发病率明显高于其他地方,尤其是河南安阳地区,每十万人大约有32.22人次因为食管癌死亡,比食管癌低发区的云南发病率高30倍之多。食管鳞癌的发病机制非常复杂,是一个发生多环境因素参与、多基因变异及多阶段逐步发生的过程。饮酒,吸烟,营养摄入不足,机体所处的环境和遗传信息差别均与食管鳞状细胞癌的发病率有关。其中遗传信息的差别及食管鳞癌发病率之间的关系是研究的热点之一。在某种环境下长期生存的个体,由于环境的长期选择作用,机体针对特定的环境特性形成相应的基因点突变,此为个体遗传物质差异的重要表现,体现出单碱基突变水平的基本遗传物质的遗传变异,此即单核苷酸多态性(SNP)。发生SNP的类型和频率具有明显的种族,地域的差异,因此,常见于某地区或民族的SNP等位基因在其他地区或民族可能很少见,这些遗传变异解释了为何人体对疾病易感性、疾病的严重程度及治疗效果存在差异。近年来,复杂性疾病的功能性SNP及对药物、毒物反应相关SNP的研究已经取得进展,SNP在功能性疾病发生发展中的作用也逐渐被揭示。DNA双链断裂(DSB)是一种严重的DNA损伤形式,包括编码基因的丢失,染色体缺失、重排、重组等变化均会对细胞造成严重后果,随后将导致细胞功能失常,从而引起细胞死亡或肿瘤的发生。而DSB损伤的修复主要是通过非同源末端连接修复(nonhomologous end joining,NHEJ)及同源重组修复(homologousrecombination,HR)两条途径完成的。本研究所涉及的两个基因PRKDC、XRCC4就是NHEJ通路的重要组成部分,其基因多态性可能与食管鳞癌的发生密切相关。目的本研究针对环境与遗传背景相对一致的食管鳞癌患者以及与之相匹配的健康人群,采用候选基因的方法,应用目前准确、高通量的DNA测序技术及PCR-RFLP技术检测PRKDC及XRCC4基因多态性,探讨他们与食管鳞癌发病相关联的遗传易感因素,为人群中高危个体的筛选、实施有针对性的干预、预防等措施,降低食管鳞癌的发生提供重要的理论依据。方法本研究采用病例-对照的研究方法,收集在河南省安阳肿瘤医院住院的食管鳞癌患者共189例,平均年龄60.23+7.91岁,所有病例均经胃镜检查病理活检或手术切除后病理组织学检查确诊为食管鳞状细胞癌；所有标本采集于术前并且未经放疗或化疗。对照为189例健康对照者,平均年龄59.40±7.86岁,均为长期居住在河南安阳地区的汉族人群、体检健康、无自身免疫性疾病及肿瘤史。所有研究对象均同意和自愿参加该项研究。患者入组后由专人询问收集病例组及对照组每个研究对象详细的人口学资料、吸烟史、饮酒史及家族史的情况。所有研究对象均于入组次日晨空腹抽取静脉血5m1保存于抗凝试管内,置于-20℃冰箱保存待测提取DNA,最后统一严格按照实验程序提取外周血DNA。查询NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)得到NHEJ修复通路中PRKDC、XRCC4基因完整的基因组序列,根据文献并利用Haploview软件选择PRKDC基因的rs7003908位点及XRCC4基因的rs1805377位点进行研究,所选的SNPs最小等位基因频率大于10%。采用RFLP法及DNA直接测序法对所有研究对象的各个位点进行基因型检测。进行酶切反应后,从酶切结果确定的各基因型中选择10个样本的PCR扩增原液样品采用DNA测序的方法明确目标基因片段的碱基顺序,两种检测结果相互印证,以证明RFLP结果的可靠性。数据以均数±标准差、频数、频率和百分比表示。利用统计学软件STATA.11以卡方检验验证基因型频率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。如符合则纳入统计分析,采用统计软件SPSS 19.0,使用独立样本t检验,对病例组和对照组的年龄进行方差齐性分析。对性别、年龄1：1配对的病例组和对照组利用单因素条件logistic回归分析法比较吸烟史、饮酒史、食管癌家族史及rs1805377 (XRCC4)、rs7003908 (PRKDC)基因多态位点的分布差异。如有显著统计学差异,则纳入条件多变量Logistic回归法分析,回归法分析计算的得数称为比值比(OR),一般临床采取其95%可信区间(CI),在此区间的数值越大,表示根据SNP计算出的人口学因素及基因型与食管鳞癌风险之间的相关性越强。实验所进行的相关的统计检验均进行双侧概率检验,统计结果P<0.05表示具有统计学意义,P<0.01表明有明显统计学差异。结果1、通过单因素条件logistic回归分析结果可见：食管鳞癌组吸烟个体87例,占46.0%,而对照组仅72例,食管鳞癌组高于对照组(38.1%)(P<0.05),经过年龄、性别校正,结果显示OR=1.882,95% CI=1.045～3.390,有明显统计学意义；2、食管鳞癌组饮酒个体54例(28.6%),明显高于对照组39例(20.6%)(P<0.05),统计显示经过年龄、性别校正OR值为1.75,95%CI介于1.010～3.031之间；3、食管鳞癌组有食管癌家族史个体68例(36.0%),明显高于对照组41例(21.7%)(P<0.05),经年龄、性别校正OR=1.929,95% CI=1.222～3.044,表明食管癌家族史在病例组及对照组差异有统计学意义。4、在XRCC4基因rs1805377、PRKDC基因rs7003908这两个位点均发现基因多态性。其基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。5、XRCC4基因rs1805377多态位点处AA基因型为野生型,AG和GG为突变型,与A/A基因型相比,A/G基因型和携带G等位基因的基因型(A/G+G/G)均不改变食管鳞癌的发病风险,经吸烟、饮酒、家族史等混杂因素校正后的OR值分别为0.933 (95%CI=0.620～1.406)、0.818 (95%CI=0.392～1.707)和0.878(95%CI=0.585-1.319),结果显示各基因型频率分布在两组间无显著性差异。6、rs7003908 (PRKDC)多态位点AA基因型为野生型,AC和CC为突变型,病例组中CC基因型频率显著高于对照组(P=0.013),经吸烟、饮酒和家族史等混杂因素校正的OR=3.637,95%CI=1.313-10.072。且吸烟、饮酒与基因多态性位点之间及各基因多态性位点之间不存在交互作用(P>0.05)。结论1.吸烟、饮酒、食管癌家族史分别作为独立危险因素,可以显著增加食管鳞癌的发病风险。2.在XRCC4基因rs1805377位点及PRKDC基因rs7003908位点均发现单核苷酸多态性。3. XRCC4基因rs1805377位点及PRKDC基因rs7003908位点基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。4. XRCC4基因rs1805377位点多态性与食管鳞癌发生无明显相关性。5.PRKDC基因rs7003908位点CC基因型可能是食管鳞癌发生危险因素,约增加患病风险3.64倍。