背景据美国癌症协会统计,2018年在美国有180万人被确诊为结肠癌,有超过80万人死于结肠癌。我国国家癌症中心发布的数据显示,肠癌的发病率持续上升,是我国发病率排在第3位的恶性肿瘤,严重威胁国民健康。结肠癌的临床治疗取得了一定的进展,但是罹患结肠癌的病人五年生存率仍处于较低的水平。天然产物在人类癌症的治疗历史中发挥着举足轻重的作用,紫杉醇、喜树碱和鬼臼毒素为代表的一大批天然化合物已经应用于肿瘤的临床治疗。杨梅素最初是从杨梅树皮中提取的一种天然色素,具有抗炎、调节生理活动、抑制肿瘤及抗菌消炎等作用。已有研究表明杨梅素可抑制包括结肠癌在内的多种人肿瘤细胞。以往的研究显示,杨梅素抑制人肿瘤细胞生长的机制包括:抑制细胞周期、诱导凋亡、抑制血管生成和转移以及调节其他相关信号通路。本文从研究杨梅素抑制多种人结肠癌细胞增殖的作用入手,同时对杨梅素诱导的结肠癌细胞凋亡及自噬、凋亡及自噬相关信号通路以及杨梅素诱导的二者的联系进行了探讨。实验方法1、检测杨梅素对HCT116、SW620、SW480和HT-29四种人结肠癌细胞增殖的抑制情况。本论文采用MTT法来观察杨梅素对上述HCT116、SW620、SW480和HT-29细胞增殖的抑制情况,从而筛选适宜的实验细胞株和实验条件(包括给药浓度和给药时间)。2、检测杨梅素对HCT116和SW620细胞凋亡的影响。采用Hoechst 33342染色检测形态的变化。使用流式细胞仪检查凋亡细胞比例。使用Western blotting方法检测经杨梅素处理后细胞中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达水平的变化。3、检测杨梅素对HCT116和SW620两种人结肠癌细胞自噬的影响。采用透射电镜检测杨梅素处理后的HCT116和SW620细胞中自噬体的形成。使用Western blotting方法检测经杨梅素处理后细胞中自噬相关蛋白LC3-II/β-actin和Beclin-1表达水平的变化。4、检测使用3-MA预处理后再经杨梅素处理的HCT116和SW620两种人结肠癌细胞中细胞增殖和凋亡的情况。用自噬抑制剂3-MA预处理两种结肠癌细胞,通过MTT法检测两种人结肠癌细胞的增殖情况。使用Western blotting方法检测经杨梅素处理后细胞中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达水平的变化。5、检测杨梅素对HCT116和SW620两种人结肠癌细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响。使用Western blotting方法检测经杨梅素处理后细胞中p-P13K、p-Akt、p-mTOR、PI3K、Akt和mTOR表达水平的变化。实验结果1、杨梅素能够显著的抑制HCT116、SW620、SW480和HT-29四种人结肠癌细胞的增殖。其中,对于HCT116和SW620两种人结肠癌细胞的增殖抑制率最高,使用100 μmol/L的杨梅素处理48 h能够达到最佳的抑制效果。2、杨梅素能够诱导HCT116和SW620两种人结肠癌细胞凋亡,并以剂量依赖性的方式上调凋亡相关蛋白Bax的表达和下调Bcl-2蛋白的表达。3、杨梅素能够诱导HCT116和SW620两种细胞发生自噬,并以剂量依赖性方式增加结肠癌细胞中LC3-II/β-actin蛋白表达的比例和Beclin-1蛋白的表达水平。4、使用3-MA能够抑制杨梅素诱导的结肠癌细胞自噬,并使结肠癌的凋亡细胞比例升高。5、杨梅素能够抑制p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的表达水平,但对PI3K、AKT和mTOR蛋白的表达水平没有影响。实验结论本研究表明,杨梅素能够通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导HCT116和SW620人结肠癌细胞发生凋亡和自噬。通过使用自噬抑制剂3-MA抑制杨梅素诱导的结肠癌细胞自噬能够增加杨梅素诱导的结肠癌细胞凋亡。研究意义本研究首次证实了杨梅素能够诱导人结肠癌细胞自噬,并且抑制这种自噬可以增加杨梅素诱导的人结肠癌细胞凋亡。这表明杨梅素可能通过发挥自身的抗肿瘤作用或者通过与自噬抑制剂合用而成为结肠癌化学治疗的候选药物。本研究为进一步探讨杨梅素抗肿瘤作用机制以及杨梅素在结肠癌药物治疗中的应用奠定了理论基础。