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目的研究Ras激活因子类似物2(RASAL2)在食管鳞癌(ESCC)中的表达及对食管鳞癌细胞生物学功能的影响,即调节ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力,为食管鳞癌的分子药物靶点,开发新的抗肿瘤药提供理论基础。方法1、采用免疫组化方法检测ESCC组织中RASAL2的表达情况,并用RT-PCR和Western blot方法进一步检测ESCC细胞中RASAL2的表达情况。2、采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立RASAL2稳定敲除的ESCC细胞系。实时荧光定量PCR和Western blot法用于检测RASAL2的m RNA和蛋白表达水平,确认获得RASAL2稳定敲除的ESCC细胞系。3、采用CCK-8和细胞集落形成实验方法检测各敲除组细胞的增殖情况和集落形成能力。4、采用细胞划痕实验和transwell实验观察各敲除组细胞的迁移和侵袭能力。5、采用Western blot方法检测各敲除组细胞的迁移和侵袭相关蛋白。结果1、免疫组化结果显示,RASAL2在ESCC组织中的表达低于其癌旁组织中的表达(P<0.05);经RT-PCR和Western blot检测,五种ESCC细胞中KYSE30和TE-1细胞的RASAL2表达较高(P<0.05)。2、用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建RASAL2稳定敲除的KYSE30和TE-1细胞,每种细胞分为对照组(NC)和敲除组(KD1和KD2)。实时荧光定量PCR检测两种细胞的敲除组RASAL2的m RNA表达水平,与对照组相比较,分别降至75.4%(KYSE30-KD1)、28.3%(KYSE30-KD2)、83.4%(TE-1-KD1)和0.6%(TE-1-KD2)(P<0.05);Western blot法检测两种细胞的敲除组RASAL2的蛋白表达水平,与对照组相比较,分别降至71.46%(KYSE30-KD1)、15.17%(KYSE30-KD2)、72.81%(TE-1-KD1)和31.32%(TE-1-KD2)(P<0.05),确认获得RASAL2稳定敲除的ESCC细胞系。3、CCK-8实验结果显示,KYSE30和TE-1细胞中,敲除组OD值明显高于对照组(P<0.05);细胞集落形成实验显示,敲除组细胞的集落形成数分别为123(KYSE30-KD1)、183(KYSE30-KD2)、81(TE-1-KD1)和132(TE-1-KD2),显著多于对照组细胞的集落形成数49(KYSE30-NC)和64(TE-1-NC)(P<0.01),说明敲除RASAL2可促进细胞增殖和集落形成能力。4、细胞划痕实验结果显示,敲除组细胞迁移率分别为59.67%(KYSE30-KD1)、86.25%(KYSE30-KD2)、78.20%(TE-1-KD1)和81.24%(TE-1-KD2),明显高于对照组迁移率20.14%(KYSE30-NC)和10.56%(TE-1-NC)(P<0.001),说明敲除RASAL2增强细胞的迁移能力。Transwell实验结果显示,敲除组侵袭细胞数分别为1610.00±0.86(KYSE30-KD1)、2310.00±1.33(KYSE30-KD2)、1880.66±2.88(TE-1-KD1)和2180.00±2.66(TE-1-KD2),显著高于对照组侵袭细胞数50.33±2.89(KYSE30-NC)和33.66±1.11(TE-1-NC)(P<0.001),说明敲除RASAL2增强细胞的侵袭能力。5、Western blot检测蛋白表达结果显示,KYSE30和TE-1细胞中,RASAL2敲除通过上调RAS/RAF/ERK信号通路促进细胞增殖(P<0.05);RASAL2敲除通过激活ERK,下调E-cadherin蛋白表达,上调N-cadherin,Snail-1和ZO-1蛋白表达,从而促进ESCC细胞EMT和转移(P<0.05)。结论RASAL2在食管鳞癌中低表达,且在食管鳞癌细胞中发挥抑癌作用;RASAL2可能通过调控RAS/RAF/ERK信号通路阻滞EMT,从而抑制食管鳞癌细胞的迁移和侵袭能力。