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沙门氏菌是一种侵袭性胞内寄生菌,它可以侵入宿主细胞并在胞内存活,口服重组沙门氏菌后,细菌能外源抗原分子输送至抗原递呈细胞胞内,然后通过MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ分子递呈到细胞表面,诱导机体产生针对抗原的免疫反应。人们通过遗传手段使其减毒后,用于疫苗抗原的输送载体,减毒沙门氏菌做为疫苗抗原载体具有生产成本低、安全、遗传稳定等优点。此外,沙门氏菌一种兼性厌氧菌能富集于肿瘤坏死区,具有天然的肿瘤靶向性(肿瘤组织细菌数量/正常组织细菌数量>1000-10000)。肿瘤靶向性减毒沙门氏菌被广泛地用于单一治疗、联用其他抗肿瘤药物或者基因治疗载体。本论文围绕着减毒沙门氏菌的抗原携带性能和肿瘤靶向特性,开展了以下两方面的研究：1、以减毒沙门氏菌为载体的血吸虫口服疫苗开发过程中的关键技术和科学问题；2、将肿瘤靶向性减毒沙门氏菌做为天然的前药激活工具及其应用。第一部分,我们以在临床I期证实安全性的msb和puri毒性基因缺失的减毒沙门氏菌VNP20009为口服疫苗载体,表达输送双价日本血吸虫抗原Sj23LHDGST。为了合理的设计重组疫苗载体,我们采用了不同强度、不同类型的启动子(nirB和pagC),不同的分泌系统(Ⅲ型分泌系统和溶血素分泌系统)对抗原进行表达和分泌。Ⅲ型分泌表达采用沙门氏菌Ⅲ型分泌分泌信号sopE1-104即sopE蛋白的1-104个氨基酸序列与抗原融合来实现,溶血素分泌表达采用溶血素分泌表达载体pMohly1,我们构建了三种疫苗载体：pagC-sopE1-104-Sj23LHDGST(pagC) nirB-sopE1-104-Sj23LHDGST(nirB)和pMohly-Sj23LHDGST(pMohly),并评价了它们诱导的免疫反应和保护性效果。Western blotting和荧光结果显示：各载体均能表达并将抗原分泌到巨噬细胞胞内,其中pagC载体抗原表达量最大,nirB只能在厌氧和胞内条件下才能表达抗原。在各个重组载体中,pagC产生的抗原特异性总IgG抗体滴度最高,nirB只产生了较微弱的IgG抗体,而pMohly不能IgG抗体；与总IgG滴度不同,nirB产生的IgG2a/IgG1最高。同时,nirB重组菌免疫小鼠脾细胞体外经重组抗原刺激后,能产生较高水平的IFN-y,并能显著上调CD4CD69和CD8CD69双阳性细胞比例(p<0.05)。与空载菌和其它两组重组菌相比,nirB重组菌免疫小鼠脾细胞中CD44表达显著上升(p<0.001)。三组重组菌中,nirB和pMohly在20天内与野生型沙门氏菌相比,其在脾脏与PP结中的细菌数量没有差异,显示nirB和pMohly质粒在细菌载体中表达稳定,没有丢失；相反,pagC在口服3天后,脾脏中重组菌数量显著下降(p<0.001),而在PP结甚至没有检测到pagC重组菌。小鼠保护性试验结果显示,nirB菌减虫率和肝脏减卵率分别为41.69%和57.71%、pagC菌分别为26.89%和30.07%、pMohly菌分别为32.93%和40.46%。通过以上结果,我们得出结论：nirB载体(厌氧诱导的Ⅲ型分泌抗原表达载体)是一种有效的血吸虫沙门氏菌口服疫苗重组载体。为了增强此血吸虫沙门氏菌口服疫苗(nirB)的免疫原性,提高保护力,我们采用了异质加强免疫策略(Heterologous prime-boost),即口服细菌免疫后再经过一次重组蛋白进行冲击。高通量细胞因子分析发现,异质加强策略可以显著提高口服疫苗免疫小鼠脾细胞IL-2的分泌(p<0.05),并能使减虫率提高到51.35%,减卵率提高到了62.59%。另外,我们还研究了研究了鸡尾酒式口服疫苗的保护效率,即将携带不同抗原(Sj23LHD、GST和TPI)的重组菌进行混合免疫,研究发现鸡尾酒疫苗比单一抗原疫苗具有更高的保护力。同时与Sj23LHD和TPI疫苗相比,GST疫苗具有更高的保护效率(p<0.05)。结论：异质加强免疫策略可以增加沙门氏菌口服疫苗抗原免疫原性,提高口服疫苗的保护力,鸡尾酒式口服疫苗比单一抗原口服疫苗更有效。嘌呤核苷酸磷酸酶/6-甲基嘌呤-2-脱氧核糖核苷(PNP/6MePdR)系统是一种具有广谱抗肿瘤效果前药治疗系统,它利用大肠杆菌PNP酶(嘌呤核苷酸磷酸酶)将前药6MePdR转化为活性抗肿瘤药物6MeP。人们利用各种靶向性载体将PNP酶特异性运输到肿瘤组织以实现肿瘤特异性激活前药,达到肿瘤靶向治疗的目的。本论文的第二部分,通过分析鼠伤寒沙门氏菌PNP酶(sPNP)与大肠杆菌PNP酶(ePNP)序列同源性并检测sPNP对前药6MePdR的激活特性,探讨将肿瘤靶向性减毒沙门氏菌做为一种天然的前药激活工具,在小鼠肿瘤模型上评价联用细菌与6MePdR的抗肿瘤效果,开发一种细菌/前药治疗系统。结果显示,sPNP与ePNP具有96%的序列同源性。转染sPNP的B16F10细胞能够剂量依赖性地表现出对6MePdR敏感；组成型表达内源性sPNP的肿瘤靶向性减毒菌株VNP20009能将6MePdR转化为6MeP。动物实验结果显示：与VNP20009或6MePdR单独治疗组相比,细菌与前药联用在能显著抑制肿瘤生长(P<0.001),并具有协同的抗肿瘤效果；联用还能增加肿瘤细胞凋亡和肿瘤组织浸润的CD4或CD8 T细胞数量。肿瘤靶向性沙门氏菌／6MePdR系统是一种高效、简便、安全的肿瘤治疗系统。