目的：探讨丙酮沉淀法提取尿蛋白的影响因素,优化丙酮沉淀法富集尿蛋白实验流程。方法：(1)收集健康成年男性和女性各6例晨起第一次尿液50mL,将男性和女性的尿液标本分别混合,-80℃下保存备用。(2)实验分组：①根据是否加入防腐剂异噻唑啉酮分为两组；②根据尿液解冻方法不同分为两组；③根据尿液与丙酮的体积比不同分为两组,④根据尿液中加入丙酮后放置时间的不同分为五组。(3)主要步骤：解冻尿液标本,加入丙酮静置,4℃下离心,提取蛋白。Bradford法测量尿蛋白浓度,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)较各组间蛋白有无差异。结果：1、防腐剂对丙酮沉淀提取尿蛋白没有明显影响；2、冰冻尿液在37℃下解冻和在常温下解冻对丙酮沉淀提取的尿蛋白成分没有影响；3、尿液与丙酮体积比为1：3时提取的尿蛋白浓度高于1：1时提取的尿蛋白的浓度(P<0.05)；4、随着放置时间的延长,提取的尿蛋白浓度依次增加。结论：我们优化了丙酮沉淀富集尿蛋白的实验流程,及尿液中是否加入防腐剂对丙酮沉淀没有显著影响,可在37℃下溶解尿液样品,按尿液和丙酮体积比1：3加入丙酮,4℃静置过夜。目的：在尿液蛋白质组学研究中,建立一种应用硝酸纤维素(nitrocellulose, NC)膜快速富集和储存大量尿蛋白的样品处理方法。方法：(1)收集健康男性和女性志愿者各2人晨起第一次尿液250mL,取等量尿液混合,平均分为20mL每管,—80℃冻存待用。(2)取20mL尿液,按尿液与丙酮体积比1：3在4℃下沉淀过夜富集尿蛋白,重复3次。(3)取20mL尿液,冰浴中将尿液按20mL/min循环通过NC膜1分钟(尿液一次通过NC膜的时间)、10分钟、30分钟、1小时、2小时和15小时,每个时间段重复3次。(4)取尿液20mL,按步骤(3)方法通过NC膜0分钟,将吸附有蛋白的NC膜置一80℃冻存6个月,重复3次。(5) Bradford法测量尿蛋白浓度,应用t检验的方法比较丙酮沉淀富集和NC膜各时间段吸附的尿蛋白含量。(6)应用SDS—PAGE初步比较丙酮沉淀富集和NC膜吸附的尿蛋白。(7)应用液相色谱分离串联质谱(LC-MS/MS)鉴定丙酮沉淀富集、NC膜吸附和冻存的尿蛋白。结果：1、NC膜能够快速吸附尿蛋白,lmin-2h时蛋白量无显著差异(P>0.05),15小时时吸附的尿蛋白量最多(P<0.05)。丙酮沉淀法富集的蛋白量较NC膜吸附lmin-2h多(P<0.05),较NC膜吸附15小时无显著差异(P=0.953)。2、SDS-PAGE结果显示,与丙酮沉淀法相比,NC膜吸附法包含了丙酮沉淀的主要蛋白条带,但明显减少了白蛋白的富集。3、LC-MS/MS鉴定结果显示,丙酮沉淀法、NC膜吸附0分钟和NC膜吸附15小时三组分别鉴定到628、619和323个蛋白,三组质谱鉴定的重复率分别为82.7%、76.7%和60.5%。4、丙酮沉淀富集和NC膜吸附的尿蛋白分子量和蛋白等电点没有明显的差异。9、尿蛋白在NC膜上冰冻6个月后,共鉴定到蛋白656个,质谱鉴定的重复率为80.2%,与丙酮沉淀和NC膜吸附的新鲜尿蛋白数目相似。结论：1、通过与丙酮沉淀法比较,我们建立了一种简便快捷的尿液蛋白吸附方法：NC膜吸附法；2、NC膜吸附法适用于处理大规模的临床尿液样品；3、NC膜吸附法可以用来储存大量尿液标本中的蛋白。目的：随着蛋白质组学技术不断发展,我们可以通过尿液蛋白质组学研究来寻找疾病的尿液蛋白标志物。由于人类的尿液蛋白质组存在很大的动态变化,本研究通过分析正常人尿液蛋白质组来确定尿液蛋白质组学研究时所需最小样本量,这在临床蛋白质组学研究中具有重要意义。方法：(1)样品收集：收集20名健康志愿者(10男,10女)过夜尿；(2)丙酮沉淀法富集尿液蛋白后,进行胰酶酶切；(3)应用1DL-MS/MS方法鉴定蛋白：为了全面鉴定尿液蛋白质组,对每个蛋白样品进行多次重复的1DL-MS/MS鉴定。(4)通过统计学分析,确定尿液蛋白质组学研究所需最小样本量。结果：(1)在男性和女性组中,当样本量超过9时,每增加一个样品,新增蛋白或肽段的数目<5%。(2)在男性和女性样品混合组中,当样本量超过9时,每增加一个样品,新增蛋白或肽段的数目<5%。(3)统计学分析发现,男性和女性尿液蛋白质组表达谱有一定的差异。结论：为了全面鉴定人类尿液蛋白质组表达谱,最小样本量可以为6例；为了达到更好的蛋白鉴定效果,样本量可以为10例；一组样本中,男性和女性样本量最好平衡。目的：评估相对和绝对定量的等量异位标签技术(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation, iTRAQ)技术的定量效果；应用LC-MS/MS方法建立代谢综合征(metabolic syndrome, MetS)早期肾损害尿液蛋白质组表达谱；采用谱图数定量和iTRAQ标记定量两种方法鉴定MetS早期肾损害尿液差异蛋白；应用Western Blot方法验证候选蛋白标志物。方法：(1)iTRAQ定量方法的评估：应用iTRAQ标记试剂114、115、116和117标记已知分子量的标准肽段混合物(tryptic peptide test mix4, TP4);由114-117标记后样品分别按1：1：1：1和1：2：4：6混合；应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)检测114、115、116和117之间的比例。(2)病例分组：将入选者分为健康对照(组Ⅰ：6例)、MetS合并正常白蛋白尿(组Ⅱ：6例)和MetS合并微量白蛋白尿(组Ⅲ：6例)三组。(3)尿液收集和处理：收集组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ患者的过夜尿；丙酮沉淀法富集尿液蛋白；将每组6例尿蛋白进行组内混合,后进行蛋白酶切及肽段除盐。(4)iTRAQ标记：取等量组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ酶切后肽段进行混合作为内标；iTRAQ标记试剂114、115、116和117分别标记内标、组Ⅰ组Ⅱ和组Ⅲ样品；标记后进行1：1：1：1混合。(5)质谱鉴定：应用LC-MS/MS分别鉴定组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ及iTRAQ标记后的混合蛋白样品。(6)蛋白相对定量及差异蛋白确定：采用谱图数定量法和iTRAQ标记定量法相对定量组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ中的蛋白；采用ANOVA检验比较三组间差异蛋白,应用Tukey检验进一步分析两两间差异蛋白。(7)蛋白功能分析：应用Panther软件分析两种定量方法共同鉴定到的差异蛋白的分子功能、参与的生物过程和分子通路。(8)蛋白验证：应用Western Blot方法在正常人、MetS合并正常白蛋白尿和MetS合并微量白蛋白尿患者的尿液标本中验证CP、APOA4和EGF蛋白的表达。结果：(1)在MALDI-TOF/TOF质谱扫描中被检测到的标准多肽峰869、1262和1353均被iTRAQ试剂标记；标记试剂114-1]7标记的样品按1：1:1：1和1：2：4：6混合后,经MALDI-TOF/TOF扫描,114、115、116和117之间的比例基本符合上述比例。(2)非标记的组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ蛋白样品,分别鉴定到807、630和456个蛋白；iTRAQ标记后的混合蛋白样品共鉴定到566个蛋白。(3)通过谱图数定量,发现三组间差异蛋白共有156个,其中组Ⅰ与组Ⅱ间差异蛋白有88个,组Ⅱ和组Ⅲ间差异蛋白有64个：通过iTRAQ标记定量,发现三组间差异蛋白共有209个,其中组Ⅰ与组Ⅱ间差异蛋白有156个,组Ⅱ和组Ⅲ间差异蛋白有118个；两种定量方法,共同发现的三组间差异蛋白有73个,其中组Ⅰ与组Ⅱ间差异蛋白有37个,组Ⅱ与组Ⅲ间差异蛋白有21个。(4)蛋白功能分析结果显示,三组间差异蛋白的分子功能主要为结合功能、催化活性和酶调节活性；差异蛋白参与的生物过程主要为代谢过程、细胞过程和免疫过程；差异蛋白参与的分子通路最主要的为凝血通路。(5)Western Blot验证结果显示,CP和APOA4在组Ⅲ中的表达显著高于组Ⅰ和组Ⅱ；EGF在组Ⅱ和组Ⅲ中的表达显著低于组Ⅰ,与质谱鉴定结果相符。结论：(1)我们应用LC-MS/MS鉴定,建立了正常人、MetS合并正常白蛋白尿和MetS合并微量白蛋白尿患者的尿液蛋白质组表达谱。(2)采用谱图数定量和iTRAQ标记两种定量两种方法鉴定到了三组之间的尿液差异蛋白。(3)通过验证,CP和APOA4可以作为MetS早期肾损害的候选蛋白标志物；EGF可作为MetS的候选蛋白标志物。