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猪圆环病毒2型(PCV2)是引起以断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)为主的一系列疾病的致病因子,由PCV2引发的疾病称为猪圆环病毒病(PCVD)。PCVD在世界各养猪国家均有发生,给养猪业造成严重的经济损失。PCV2为无囊膜的DNA病毒,为圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)的成员,基因组为不分节的单股负链闭合环状DNA。PCV2基因组长度为1766~1768 bp,存在多个开放性阅读框(ORFs),目前已经有研究报道的有6个ORFs,其中ORF1编码病毒复制酶相关蛋白Rep与Rep’;ORF2编码病毒衣壳蛋白Cap;ORF3编码病毒促凋亡蛋白;ORF4编码抗凋亡蛋白的;ORF5可引起宿主细胞质网应激(ERS)。PCV2可引起ERS进而诱发细胞自噬,促进PCV2的复制增殖。PCV2 ORF5蛋白是否会引起宿主细胞的自噬作用,在病毒感染和复制增殖中是否发挥作用?这些问题是揭示ORF5蛋白在PCV2感染中作用的一个重要方面。本研究明确了ORF5诱导猪肺泡巨噬细胞(PAMs)自噬途径,ORF5蛋白、细胞内质网应激、细胞自噬对PCV2复制的影响,并对PCV2感染猪组织细胞中内质网应激和细胞自噬与病毒载量具有相关性进行了分析。获得以下结果:(1)PCV2 ORF5蛋白通过内质网应激引起自噬。构建DsRed-ORF5真核表达载体于转染PAMs,分别用real-time RT-PCR对内质网应激标志蛋白GRP-78和细胞自噬标志因子Beclin 1进行定量检测、Western blot检测自噬关键蛋白LC3的切割、透射电镜观察宿主细胞内自噬小体数量与内质网结构的变化。结果发现,表达ORF5组的GRP-78和Beclin 1在核酸水平均出现显著上调;LC3切割产物LC3II蛋白量显著增加;细胞内质网区域出现大量空泡结构同时细胞质中可见多个自噬小体。用内质网应激抑制剂4-PBA处理细胞后转染表达ORF5蛋白的重组质粒,检测发现抑制细胞内质网应激后,GRP-78与Beclin 1表达显著下调,LC3蛋白的切割作用也减弱,细胞内内质网空泡化和自噬小体显著减少。说明ORF5诱导的细胞自噬是由内质网应激途径介导。(2)PCV2 ORF5蛋白通过激活细胞自噬促进PCV2的复制。用PCV2感染表达ORF5蛋白的PAMs,感染后48 h,通过real-time PCR对PCV2核酸载量进行检测,可见病毒核酸载量出现显著增加。分别用4-PBA、细胞自噬抑制剂3-MA处理细胞后,转染表达ORF5蛋白的重组质粒,然后再用PCV2感染细胞,48 h后检测发现,PCV2核酸载量均出现显著下降,且两组间差异不显著。说明ORF5蛋白通过激活细胞自噬促进了PCV2的复制。(3)PCV2感染猪组织细胞中发生内质网应激和细胞自噬,程度与病毒载量呈现相关性。在临床上获得PCV2感染猪,猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测均为阴性。分别采取PCV2感染猪心脏、肝脏、肾脏、肺脏、大脑和小肠等组织,Real-time RT-PCR检测各组织中的PCV2核酸载量、GRP-78和Beclin 1表达量,透射电子显微镜观察内质网结构与自噬小体数量。结果发现,肺脏中PCV2载量最高,其次为肝脏和肾脏,小肠、心脏与大脑中较少,胃内并未检测到PCV2。GRP-78和Beclin 1在肺脏中表达水平最高,其次为小肠,再次为肝脏和肾脏。透射电镜观察可见到器官组织中存在PCV2粒子,除肺脏内含量较多外其余各组织中差异不大。各组织中均可见到自噬小体与内质网结构的变化,以肺脏内数量最多和变化最为明显,其次为肠道,其余各组织中差异较小。本研究发现,PCV2 ORF5蛋白通过内质网应激进而导致细胞自噬的发生,对PCV2的复制具有促进作用;PCV2在感染猪体内诱导了组织细胞内质网应激和自噬的发生。