【摘 要】
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背景和目的:在全球范围内心血管疾病导致的死亡人口数近年来持续上升,对心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）的研究及预防对人类健康至关重要。动脉粥样硬化是造成心血管疾病发生发展的首要原因之一,它是血管壁脂质堆积所致的慢性炎症性病变。内质网具有蛋白质合成、维持钙平衡、脂质合成等多种功能,作为人体重要的细胞器在维持正常细胞活动中起着至关重要的作用。所有扰乱内质网稳态的内在因素
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背景和目的:在全球范围内心血管疾病导致的死亡人口数近年来持续上升,对心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）的研究及预防对人类健康至关重要。动脉粥样硬化是造成心血管疾病发生发展的首要原因之一,它是血管壁脂质堆积所致的慢性炎症性病变。内质网具有蛋白质合成、维持钙平衡、脂质合成等多种功能,作为人体重要的细胞器在维持正常细胞活动中起着至关重要的作用。所有扰乱内质网稳态的内在因素或外界扰动,都会导致内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）,这种应激影响了正常的蛋白质合成修饰的过程,可导致错误折叠或未折叠的蛋白质堆积。当产生内质网应激后,未折叠蛋白质反应（Unfolded protein response,UPR）在应激下被触发并激活了一系列试图恢复内质网功能的信号通路。越来越多的证据表明,内质网应激参与心血管疾病的形成,内质网应激可能通过引起细胞功能障碍或诱导细胞凋亡而参与动脉粥样硬化的发病机制。自噬可以通过对异常蛋白、损伤细胞器的降解参与代谢底物的循环,是细胞中的一种固有机制。自噬机制也是细胞内部保持稳定状态并存活下来的关键防御机制之一。过度自噬产生的效应则会导致细胞的大量凋亡。自噬的功能异常可能会通过破坏溶酶体和自噬体,进而导致细胞损伤凋亡。它对细胞的促存活或致损伤效应可能取决于发病机制的不同阶段。自噬是心脏稳态的重要机制,最近的研究表明,内质网应激可引发自噬,提示自噬与内质网应激在细胞功能上具有协同作用,它们可能相互作用,协调细胞存活或凋亡。内皮细胞功能障碍通常被认为是动脉粥样硬化的第一阶段。因此,本实验用氧化低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein,OX-LDL）进行诱导建立人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）的凋亡模型,研究在这种细胞模型中内质网应激和自噬间的串扰及其在凋亡中的作用。研究方法:原代人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）购自icellbioscience公司,在37℃、5%二氧化碳浓度的细胞培养箱中进行培养,传至合适的代数,使用不同浓度和时间梯度的（0-200ug/ml）OX-LDL对HUVEC进行处理（0-24h）,并通过CCK8法检测细胞活性确定适宜的处理浓度和处理时间,建立OX-LDL诱导的内皮细胞凋亡的模型,并设置空白对照组、OX-LDL处理组、内质网应激激动剂处理组、内质网应激抑制剂处理组、自噬激动剂处理组、自噬抑制剂处理组。通过流式细胞术评估细胞凋亡水平、Western blot术检测与凋亡相关的蛋白,探讨内质网应激与自噬机制对内皮细胞凋亡的调控。Western blot术分别检测内质网应激及自噬相关蛋白分析内质网应激及自噬间的相互作用。结果:1.OX-LDL可促进内皮细胞凋亡:与未用药物的空白对照组比较,OX-LDL的处理明显降低了内皮细胞存活率,随着OX-LDL浓度的提高,处理时间的延长,细胞的存活率逐步下降。2.OX-LDL诱导的内皮细胞凋亡可被内质网应激调控:在OX-LDL所诱发的内皮细胞凋亡模型中,若加入内质网应激抑制剂,Western blot可检测到GRP78等内质网应激相关蛋白及细胞凋亡相关蛋白CHOP表达水平下调,流式细胞术测得细胞凋亡减少;而内质网应激激动剂的试验组中相关蛋白表达增高,细胞凋亡增加。3.OX-LDL处理诱导了内皮细胞自噬:在OX-LDL处理的细胞中,Western blot可测得自噬相关蛋白表达增高。4.内质网应激影响OX-LDL诱导的内皮细胞凋亡中的自噬水平:使用内质网应激抑制剂的实验组中Western blot测得的自噬标志蛋白表达显著下降。5.激活自噬可抑制CHOP表达并减少内皮细胞凋亡:与对照组相比,加入自噬激动剂的试验组中,内质网应激下游的p-PERK、p-IRE1蛋白水平变化无明显统计学意义,而下游蛋白CHOP表达明显下降（p＜0.05）,流式细胞术分析测得细胞凋亡水平也明显下降。结论:抑制内质网应激及激活自噬都对内皮细胞起保护作用,内质网调控自噬,而自噬对内质网应激信号通路下游的CHOP蛋白有一定的调节作用,它们间的复杂调控作用共同决定细胞的存活与凋亡。
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