基于外泌体中lncRNA和PD-L1蛋白SERS定量的肿瘤液体活检研究

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目的:外泌体是一种可由多种细胞释放的,直径大小在30-150nm之间的细胞外囊泡,其所携带的内容物中已被证实含有DNA、RNA及蛋白质等物质。长链非编码RNA(lncRNA)是一种调节性RNA,外泌体携带的一些lncRNA可广泛参与到包括恶性肿瘤在内的疾病的进展过程中,因此其对恶性肿瘤具有诊断等价值。由于血浆或血小板源lncRNA也被研究发现可用作肿瘤诊断标志物,但目前缺乏对三者诊断效能的比较。因此在本研究中,我们通过对相同患者来源的血浆外泌体、血小板及血浆中特定lncRNA进行检测,比较三种样本中该lncRNA水平与非小细胞肺癌(NSCLC)患者临床病理特征的关联性异同以及用于NSCLC诊断的效能优劣,从而为新型肿瘤标志物的选择提供依据;此外,外泌体携带的PD-L1蛋白参与肿瘤免疫逃逸,血浆外泌体PD-L1水平具有用于指导抗PD1免疫治疗的潜能。但当前缺乏血浆外泌体PD-L1蛋白检测的适宜手段,因此我们结合表面增强拉曼散射技术建立了外泌体PD-L1蛋白检测体系,旨在提供一种可靠的血浆外泌体PD-L1蛋白检测方法。
  方法:使用商品化血浆外泌体试剂盒提取NSCLC患者血浆外泌体,多步离心法分离血小板及血浆。1.提取上述三种样本的总RNA并使用qRT-PCR方法检测血浆外泌体、血小板及血浆中lncRNACTA-384D8.35的水平,分析其水平在NSCLC患者与健康人之间的差异以及三者间水平是否具有关联性。结合NSCLC患者临床病理特征分析三种样本CTA-384D8.35水平与疾病进展特征的关联性,比较三种样本来源CTA-384D8.35用于NSCLC诊断的效能优劣;2.结合物理学领域表面增强拉曼散射技术(SERS)建立血浆外泌体PD-L1蛋白检测体系,以CD63抗体修饰的SERS基底作为外泌体捕获基底,以SERS探针颗粒标记的PD-L1抗体作为检测抗体,利用临床标本验证该体系检测血浆外泌体PD-L1蛋白的性能。
  结果:1.NSCLC患者血浆外泌体及血浆来源CTA-384D8.35水平均较健康人显著增高,血小板源CTA-384D8.35水平较健康人显著降低;NSCLC患者血浆外泌体中CTA-384D8.35水平与血浆中CTA-384D8.35水平具有显著相关性,血小板中CTA-384D8.35水平与血浆外泌体及血浆中CTA-384D8.35水平无关联性;NSCLC患者血浆外泌体及血浆中CTA-384D8.35水平与患者肿瘤标志物水平及肿瘤分期有关,血小板中CTA-384D8.35水平与患者肿瘤标志物水平及肿瘤分期等无关联性;血浆外泌体、血小板及血浆源CTA-384D8.35对NSCLC均有一定的诊断效能,血浆外泌体源CTA-384D8.35与血浆源CTA-384D8.35用于NSCLC诊断的效能相似,而血小板源CTA-384D8.35用于NSCLC诊断的效能高于血浆外泌体及血浆源CTA-384D8.35;联合血浆外泌体与血浆源CTA-384D8.35用于NSCLC诊断时,其效能较单独血浆外泌体或血浆无明显提高,联合血小板与血浆外泌体或血浆源CTA-384D8.35用于NSCLC诊断时,其效能较单独血浆外泌体或血小板或血浆均有明显提高。2.我们建立了有效的用于血浆外泌体PD-L1蛋白定量的检测体系。该检测体系具有较好的特异性,血浆外泌体非特异性吸附少;性能稳定可靠,在适宜的样本浓度范围内,检测结果与外泌体浓度具有近似线性关系;使用临床肝癌患者标本、肝硬化患者标本及健康人标本进行血浆外泌体PD-L1蛋白检测,检测结果在各组间分布较为集中,且肝癌组结果显著高于肝硬化组结果,且两者均显著高于健康人组结果,表明该检测体系用于临床样本检测时具有较好的适用性。
  结论:1.血浆外泌体、血小板及血浆源CTA-384D8.35对NSCLC均有一定的诊断效能,且血浆外泌体源CTA-384D8.35与血浆源CTA-384D8.35诊断效能相似,血小板源CTA-384D8.35诊断效能略高;血浆外泌体与血浆源CTA-384D8.35水平与NSCLC患者疾病进展相关,而血小板源CTA-384D8.35水平与患者疾病进展无显著相关性;血浆外泌体源CTA-384D8.35水平与血浆源CTA-384D8.35水平高度相关,血浆中的CTA-384D8.35可能主要来自于外泌体携带的CTA-384D8.35。联合血小板与血浆外泌体源CTA-384D8.35用于NSCLC诊断可提高血浆外泌体源CTA-384D8.35的诊断效能。2.我们建立的基于SERS的血浆外泌体PD-L1蛋白检测体系具有较好的可靠性、稳定性和特异性,该检测体系显示出较好地适用于临床样本检测的能力。
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