神经病理性痛的治疗一直是困扰临床工作者的一大难题。目前的治疗药物主要有抗抑郁药、抗癫痫药、局麻药、阿片类、非类固醇类消炎药等，这些药物的疗效通常不令人满意且带来较多的副作用。因此，开发疗效确切且副作用较少的预防及治疗神经病理性痛的药物具有重要意义。近年来，国内外学者在该领域也进行了大量研究，从多角度来阐明神经病理性痛的发病机制，并试图从多个靶点来研发相应的治疗药物。大量实验结果显示，胶质细胞在神经病理性痛发生和发展中起到重要作用。迄今为止，在很多神经病理性痛模型中都观察到神经胶质细胞表型以及功能的改变，其主要发生在脊髓中，同时也可以在其他高级脑区甚至外周神经系统中观察到该现象。研究表明，抑制神经胶质细胞及其所表达的分子，可以对神经病理性痛起到预防或治疗作用，这提示神经胶质细胞可能在神经病理性痛发生和发展中起到重要的作用。研究显示，神经损伤会诱导小胶质细胞活化，使活化的小胶质细胞中P2X4受体表达量增加，推测P2X4受体与神经病理性痛有着紧密联系。Tsuda等[1]发现当神经损伤发生后，大鼠机械痛痛阈逐渐降低，同时其损伤侧脊髓背角P2X4受体的表达量逐渐升高；免疫组化实验证明，P2X4受体在小胶质细胞中表达较高。此后在大鼠自身免疫性神经炎模型[2]、大鼠慢性结扎损伤眶下神经模型[3]及大鼠福尔马林炎性痛模型[4]上，研究者们发现模型动物在出现机械痛痛阈逐渐降低的同时，P2X4受体表达量逐渐增加。以上研究提示P2X4受体在神经病理性痛的发生发展过程中可能具有重要作用。Tsuda等[1]发现脊髓损伤诱导大鼠机械痛阈降低的同时，小胶质细胞活化，而鞘内给予P2X受体拮抗剂TNP-ATP（P2X受体P2X1-4受体亚型拮抗剂[22]）能够使这一现象得到改善，而P2X受体的另一拮抗剂PPADS（P2X受体P2X1–3,5,7受体亚型拮抗剂[22]）则对此无作用。鞘内注射ATP活化的小胶质细胞能够诱发大鼠机械痛痛阈降低，进一步鞘内注射TNP-ATP后，能够逆转活化的小胶质细胞诱发的痛阈降低，而注射PPADS后大鼠机械痛痛阈无明显变化。由于TNP-ATP是P2X4受体非选择性拮抗剂，而PPADS对P2X4受体几乎无效，提示TNP-ATP的药理学作用可能与P2X4受体相关。于脊髓损伤模型大鼠鞘内给予P2X4受体反义寡聚核苷酸，使脊髓小胶质细胞中P2X4受体表达量降低的同时也显著降低了了大鼠痛敏程度。通过P2X4受体基因敲除小鼠进行的一系列实验，证实了其在神经病理痛发生过程中的作用[5]。上述资料显示，若能靶向抑制P2X4受体的作用，则可能对神经病理性痛起到一定的缓解和治疗作用。因此，本课题研究如下：研究目的：以P2X4受体及现有P2X4受体拮抗剂为基础，通过计算机辅助药物设计及传统的药物设计，设计新的P2X4受体拮抗剂，并从中筛选出活性化合物，进一步评价其时效及量效关系。研究方法：1.建立大鼠CFA、SNI及小鼠SNI神经病理性痛模型，在造模成功后的不同时间点，对模型动物的手术侧及对侧丘脑、杏仁核、下丘脑、延髓、脊髓和纹状体等部位进行取材，通过qRT-PCR及蛋白免疫印迹实验检测P2X4受体和BDNF的变化。2.以zfP2X4受体的晶体结构对hP2X4受体进行同源模建，基于受体和现有配体进行P2X4受体拮抗剂的设计。基于受体的药物设计，利用模建好的晶体结构找到可能的与配体结合的活性位点进行化合物的虚拟筛选；基于配体的药物设计，根据P2X4受体非选择性拮抗剂TNP-ATP建立药效团模型，筛选化合物。应用传统的药物设计，根据论著及专利中报道的P2X4受体拮抗剂进行骨架跃迁，找到化合物新骨架，得到改造后的化合物。在计算机水平对设计的化合物筛选后，进一步进行细胞水平及整体动物水平的筛选。3.SNI模型小鼠初步筛选有镇痛效果的化合物；建立HEK293-pEGFP-N1-rP2X4稳转细胞系，应用膜片钳技术在建立好的细胞系上对动物水平筛选出的化合物进行验证。对动物及细胞水平均有活性的化合物进行初步评价。研究结果：1.CFA模型大鼠在造模8h时，丘脑、脊髓及背根神经节中P2X4受体mRNA水平明显升高，其下游信号分子BDNF的mRNA表达量在脊髓中明显上调；SNI模型大鼠在造模4天时，手术对侧杏仁核中P2X4受体蛋白表达量明显增加。造模7天时，纹状体、杏仁核及手术对侧下丘脑中P2X4受体蛋白表达量明显增加；SNI模型小鼠在造模4天时，手术侧杏仁核及丘脑中P2X4受体mRNA水平升高。造模7天时，手术侧杏仁核中P2X4受体mRNA水平升高。这些结果提示P2X4受体的表达与神经病理性痛关系密切。2.基于受体的药物设计，根据资料分析，找到P2X4受体3个活性位点，并基于这3个位点进行虚拟筛选，筛选出600个化合物；基于配体的药物设计，根据TNP-ATP的结构建立药效团模型进行虚拟筛选，并根据现有P2X4受体拮抗剂应用传统的药物设计进行骨架跃迁，共设计出3933个化合物。3.通过可视化筛选分别对基于受体及配体设计的化合物筛选出96及114个化合物，首批从中选出24个化合物进行合成。4.在小鼠SNI模型上，对P2X4受体非选择性拮抗剂TNP-ATP进行确证和初步筛选。P2X4受体非选择性拮抗剂TNP-ATP在给药后30min、60min及120min小鼠机械痛阈值由0.09±0.11g升高至0.91±0.7g、0.92±0.46g及0.93±0.59g；化合物L-01-01在给药后60min小鼠机械痛阈值由0.15±0.09g升高至1.14±0.90g；化合物L-01-02在给药后60min及120min小鼠机械痛阈值由0.12±0.11g升高至0.43±0.49g及0.45±0.30g；化合物L-01-10在给药后120min小鼠机械痛阈值由0.22±0.21g升高至0.55±0.22g；化合物L-01-21在给药后30min小鼠机械痛阈值由0.04±0.03g升高至0.34±0.23g；化合物L-01-22在给药后90min小鼠机械痛阈值由0.03±0.02g升高至0.88±1.41g。5.建立HEK293-pEGFP-N1-rP2X4稳转细胞系，从基因及蛋白水平证明了细胞系rP2X4受体过表达，应用膜片钳技术证明细胞系功能完整；在该细胞系上，应用膜片钳技术对P2X4受体非选择性拮抗剂TNP-ATP进行确证并对首批选出的化合物进行初步筛选。P2X4受体非选择性拮抗剂TNP-ATP及化合物L-01-01几乎完全阻断P2X4受体ATP激活电流，L-01-05能够阻断P2X4受体ATP激活电流，抑制率为41.90±3.85%。6.化合物L-01-01对小鼠自发活动的影响，地西泮在给药10min、30min及60min后小鼠运动距离明显减少；P2X4受体非选择性拮抗剂TNP-ATP在给药10min及60min后小鼠运动距离明显减少；化合物L-01-01在给药60min后小鼠运动距离明显减少。结论：P2X4受体与神经病理性痛关系密切；通过计算机模拟，基于受体及配体共设计P2X4受体拮抗剂3933个；经可视化筛选获得P2X4拮抗剂24个，其中5个表现出抗神经病理性痛作用。建立了HEK293-pEGFP-N1-rP2X4稳转细胞系并验证了化合物L-01-01的药理作用。