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目的:侵袭和转移是影响食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者预后的主要原因,积极深入探讨影响食管鳞癌侵袭转移的分子机制,对提高患者生存具有重要的临床意义。高迁移率蛋白A2(High mobility group protein A2,HMGA2)是一种非组蛋白染色质相关蛋白,它可通过改变染色质的结构来调节其他基因的转录。HMGA2已被证实在多种肿瘤中高表达,与肿瘤的发生发展和不良预后密切相关,然而其在食管鳞癌中的表达与调控机制目前尚不明确。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一类内源性的单链非编码RNA,可通过对靶基因的转录后调控参与生命过程中一系列重要过程。mi R-204-5p和miR-137已被证实在多种肿瘤中异常表达,与肿瘤的增殖、转移、凋亡等恶性生物学行为相关,但与食管鳞癌的关系尚不明确。本研究旨在明确HMGA2及miR-204-5p和miR-137在食管鳞癌中的表达及其与患者临床病理特征和预后的关系,并进一步通过体外实验明确其对食管鳞癌细胞增殖、侵袭转移能力的影响,明确miR-204-5p和mi R-137靶向HMGA2基因调控食管鳞癌侵袭转移的分子机制,为阐明食管鳞癌转移的分子机制和寻找新的肿瘤基因治疗靶点提供理论支持。方法:1、采用qRT-PCR和Western blot方法检测52例新鲜食管鳞癌患者癌组织及对应癌旁组织标本中HMGA2 mRNA和蛋白的表达情况。采用免疫组化SP法检测178例食管鳞癌患者石蜡组织标本中HMGA2蛋白的表达,分析其表达水平与患者临床病理资料之间的相关性及其对患者生存的影响。2、选出HMGA2高表达的食管鳞癌细胞系,首先应用RNA干扰技术抑制细胞系中HMGA2的表达,MTT实验检测HMGA2对细胞增殖的影响,克隆形成实验检测HMGA2对细胞克隆形成能力的影响,划痕愈合实验检测HMGA2对细胞迁移能力的影响,Transwell实验检测HMGA2对细胞侵袭能力的影响。随后应用Western blot及细胞免疫荧光实验观察干扰细胞系中HMGA2的表达后上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关指标表达的变化。最后应用免疫组化方法检测食管鳞癌组织中HMGA2与EMT相关指标表达的相关性。3、采用qRT-PCR技术检测52例食管鳞癌患者新鲜癌组织与癌旁组织标本中miR-204-5p和miR-137的表达水平,分析其相对表达水平与患者临床病理特征的关系。在食管鳞癌细胞系中上调miR-204-5p或miR-137的表达后,首先应用上述实验方法检测食管鳞癌细胞增殖、侵袭迁移能力的变化,并进一步采用Western blot技术检测细胞中HMGA2蛋白表达水平的变化,最后在食管鳞癌组织标本中分析mi R-204-5p或mi R-137与HMGA2 mRNA之间表达的相关性。4、验证miR-204-5p或miR-137对HMGA2基因的靶向调控,利用Target Scan和miRanda等信息学软件分析miR-204-5p或mi R-137与HMGA2基因启动子区域可能的结合靶点,双荧光素酶报告基因实验验证二者对HMGA2基因的直接负性调控。在食管鳞癌细胞中共转染入mi R-204-5p mimic或mi R-137 mimic及HMGA2过表达质粒后,划痕愈合实验和Transwell实验检测癌细胞迁移和侵袭能力的改变。结果:1、qRT-PCR和Western blot结果显示:HMGA2 mRNA和蛋白在新鲜食管鳞癌组织中的相对表达水平明显高于癌旁正常食管黏膜组织;免疫组化检测结果显示HMGA2蛋白在食管鳞癌组织中的高表达率明显高于正常食管黏膜组织中的表达率(52.8%vs.27.5%,P=0.004)。HMGA2的表达水平与肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关(P<0.05);HMGA2高表达患者5年生存率明显低于HMGA2低表达患者(24.9%vs 42.3%,P=0.009),多因素分析显示,HMGA2表达是影响本组食管鳞癌患者预后的独立危险因素(HR 1.484,95%CI 1.012~2.175,P=0.040)。2、HMGA2在食管鳞癌Kyse-30和Ec-109细胞系中高表达,RNA干扰技术可有效降低食管鳞癌细胞中HMGA2的表达水平。MTT和克隆形成实验发现,下调HMGA2表达后可明显降低食管鳞癌细胞的增殖和克隆形成能力;划痕愈合和Transwell实验表明,下调HMGA2表达后可明显抑制食管鳞癌细胞的迁移和侵袭能力。3、Western blot法检测发现,干扰食管鳞癌Kyse-30和Ec-109细胞中HMGA2的表达后,上皮性指标E-cadherin的表达明显升高,间质性指标N-cadherin,Vimentin及Snail的表达显著降低;细胞免疫荧光法检测发现,下调HMGA2的表达后,E-cadherin胞膜表达增加,N-cadherin的胞浆表达减弱。同时,细胞中β-catenin由细胞浆及细胞核向胞膜转移,与细胞膜结合的β-catenin明显增加。4、qRT-PCR检测显示,在食管鳞癌组织中mi R-204-5p和miR-137的表达水平均显著低于癌旁组织(P<0.01);miR-204-5p表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移显著相关(P<0.05),miR-137表达与肿瘤大小、浸润深度显著相关(P<0.05);上调Kyse-30和Ec-109细胞中miR-204-5p或miR-137的表达后,细胞的增殖、迁移和侵袭能力均受到明显的抑制,同时可明显降低HMGA2蛋白的表达水平;相关性分析结果显示在食管鳞癌组织中mi R-204-5p或miR-137的相对表达水平均与HMGA2 mRNA的表达水平呈显著性负相关性(r2=0.609及0.682,P均<0.001)。5、TargetScan和miRnada生物信息学预测软件提示HMGA2可能是miR-204-5p和miR-137的靶基因。双荧光素酶报告基因实验显示HMGA2是miR-204-5p和miR-137的直接作用靶基因;miR-204-5p或miR-137对食管鳞癌细胞的迁移及侵袭能力的抑制作用可以部分地被HMGA2过表达质粒所削弱。结论:1、HMGA2高表达于食管鳞癌中,并与肿瘤增殖、浸润及转移等恶性生物学行为密切相关,是患者预后不良的指标,有望成为食管鳞癌治疗的分子靶点。2、HMGA2参与了调控食管鳞癌细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭过程,是食管鳞癌细胞的恶性表型。HMGA2可通过调控β-catenin的移位,进而调控EMT的发生而促进肿瘤的转移。3、miR-204-5p和miR-137均低表达于食管鳞癌中,且与肿瘤的增殖、迁移及侵袭等恶性生物学表型具有一定关系。4、HMGA2为miR-204-5p和miR-137的直接调控靶基因,可通过下调HMGA2的表达抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。