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食管癌是消化系统的常见肿瘤,严重危害人类的身体健康。寻找其有效的基因靶点抑制肿瘤的生长并进行深入的功能研究,对于提高食管癌患者生存率和改善食管癌治疗具有重要的意义。实验室前期在研究食管癌抗凋亡基因PKCiota时发现,SQSTMl/p62表达受PKCiota影响,并且临床食管癌组织标本检测显示p62与PKCiota的蛋白表达正相关。p62是一个多功能的泛素化接头蛋白,在自噬调控、多条细胞信号通路以及肿瘤中发挥重要作用。目前p62在食管癌中的功能及作用机制均未有报道,为此我们对其进行了深入的研究。我们首先利用免疫荧光细胞化学技术分析了食管癌细胞系KYSE150、 KYSE180、KYSE510、KYSE450、Eca-109和COLO-680N中p62的表达水平及亚细胞定位情况,结果显示p62在COLO-680N细胞中表达较低,但在其它食管癌细胞系中均表达较高并定位于胞浆。随后我们选取KYSE450和KYSE180食管癌细胞系进行体外功能实验。采用敲降p62对细胞表型进行研究,发现在正常培养的条件下,改变p62蛋白表达不影响细胞增殖、凋亡、集落形成能力和细胞周期等表型；但经过无血清培养12h后,p62蛋白水平降低能明显促进食管癌细胞凋亡并抑制细胞集落形成能力。动物实验结果显示,p62蛋白表达降低可抑制裸鼠皮下瘤生长。基于在无血清培养状态下,p62促进食管癌细胞抗凋亡能力和细胞生存活力,我们对p62影响其细胞表型相关的分子机制进行了探究。在无血清培养条件下敲降p62, Western blot检测发现S期激酶相关蛋白(SKP2)的蛋白水平下调,同时采用RT-PCR和Real-Time PCR检测发现SKP2的mRNA水平也降低。饥饿处理状态下敲降SKP2可增加食管癌细胞凋亡水平。进一步研究表明p62通过调节PKCiota蛋白表达而影响SKP2蛋白水平。利用免疫共沉淀(Co-IP)检测发现,p62与PKCiota相互结合。加入泛素化蛋白酶体抑制剂(MG132)作用24h后发现,在无血清培养条件下敲降p62组中SKP2蛋白水平有一定的回升,免疫沉淀(IP)实验检测发现与SKP2相连的多聚泛素化(Ub)蛋白水平明显增加。随后我们构建了三个不同的p62结构域缺失突变体,检测对食管癌细胞表型的影响。结果显示p62的PB1结构域具有一定的生物活性,其缺失可明显降低食管癌细胞生存活力,同时在分子水平上证明p62结构中PB1结构域缺失可引起PKCiota蛋白水平的下调。我们利用PKCiota抑制剂Aurothiomalate (ATM)处理食管癌细胞系,发现对细胞增殖和凋亡均没有明显的作用。但当p62-siRNA和ATM联合应用,发现可以明显促进食管癌细胞凋亡、抑制细胞生存活力和细胞增殖；同时在分子水平上分析发现,p62-siRNA和ATM联合处理组中p62、PKCiota和SKP2的蛋白水平均显著降低。综上所述,p62通过PB1结构域与PKCiota相互作用,抑制SKP2蛋白泛素化降解,从而提高食管癌细胞抗凋亡能力和细胞生存活力。本研究的结果综合提示,p62有可能作为治疗食管癌的分子靶点。