第一部分piRNA在多发性骨髓中的表达及意义目的：研究piRNA在多发性骨髓患者中的表达水平及临床意义。方法：采用qRT-PCF(?)检测15例多发性骨髓瘤患者骨髓活检组织、10例CD138+骨髓瘤细胞浸润的胸、腰椎组织以及8例正常对照骨髓活检组织中piRNA-823和piRNA-651的表达水平；磁珠分选43例多发性骨髓瘤患者及18例正常对照骨髓中CD138+浆细胞,采用qRT-PCR检测piRNA-823, piRNA-651、 piRNA-4987和piRNA-Hep1在CD138+浆细胞中的表达水平,研究它们与多发性骨髓瘤临床分期之间的关系。结果：与正常对照骨髓活检组织相比,多发性骨髓瘤患者骨髓活检组织及CD138+骨髓瘤细胞浸润的胸、腰椎组织中piRNA-823表达水平明显上调,而piRNA-651的表达在这三组间无显著差异。根据国际分期系统(ISS分期)将43例多发性骨髓瘤患者分为三组,与正常对照及I期骨髓瘤患者相比,Ⅱ期和Ⅲ期患者中piRNA-823表达水平明显升高,并且随着骨髓瘤分期程度递增,piRNA-823的表达也逐渐增高；piRNA-651的表达在这四组间无显著差异；与正常对照组相比,piRNA-4987和piRNA-Hep1表达水平在Ⅲ期骨髓瘤患者中升高,但是在各组骨髓瘤瘤患者间无显著差异。结论：piRNA在多发性骨髓瘤中的表达具有异质性。其中piRNA-823在多发性骨髓瘤患者中表达上调,并且与临床分期呈正相关,提示其可能对多发性骨髓瘤预后评估具有一定的参考意义。第二部分piRNA-823对骨髓瘤细胞生物学行为的影响及作用机制目的：在体内外实验中探讨piRNA-823对多发性骨髓瘤细胞系生物学功能的影响及相关作用机制。方法：采用qRT-PCF(?)检测四种多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226、ARH-77、U266和KM3上piRNA-823的表达水平；设计合成piRNA-823特异性抑制物antagomir-823,利用脂质体将其转染至骨髓瘤RPMI8226或ARH-77细胞,下调piRNA-823的表达水平,实验设置正常对照组、阴性对照转染组及antagomir-823转染组三组。通过mRNA表达谱芯片分析下调piRNA-823表达对RPMI8226细胞生长相关信号通路的影响；采用CCK-8法检测piRNA-823沉默对骨髓瘤细胞增殖的影响；采用Annexin V FITC/PI双染法流式细胞术检测piRNA-823沉默对骨髓瘤细胞凋亡的影响；采用碘化丙啶(PI)单染法流式细胞术检测piRNA-823沉默对骨髓瘤细胞周期的影响；采用Western blotting检钡piRNA-823沉默对骨髓瘤细胞抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表达的影响；对促凋亡蛋白caspase-3和PARP活化的影响；对细胞周期调节蛋白cyclinD、CDK4和pRb表达的影响以及对信号通路蛋白AKT及ERK磷酸化水平的影响。最后建立人多发性骨髓瘤裸鼠皮下移植瘤模型,观察piRNA-823沉默对骨髓瘤细胞在动物体内生长的影响,并分别采用qRT-PCR及免疫组织化学方法检测瘤体内piRNA-823的沉默效果及Bcl-2、cyclinD1、Ki-67和caspase-3蛋白的表达情况。结果：(1) piRNA-823在四种骨髓瘤细胞系中均高表达,而piRNA-823特异性抑制剂antagomir-823能够在不影响其它非编码小RNA表达的前提下,有效地下调RPMI8226和ARH-77细胞上piRNA-823的表达水平。(2)基因芯片分析结果显示,antagomir-823转染组RPMI8226细胞中与骨髓瘤生长密切相关的一些信号通路被显著调节,包括凋亡、细胞周期、IL-6、MAPK和mTOR等信号通路。(3)CCK-8实验显示下调piRNA-823的表达48小时及72小时后可以明显抑制RPMI8226及ARH-77细胞增殖能力。(4)下调piRNA-823的表达可以诱导骨髓瘤细胞凋亡,伴随抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x1表达下降以及促凋亡蛋白caspase-3和PARP的活化。(5)下调piRNA-823的表达能够将骨髓瘤细胞阻滞在G1期,伴随细胞周期调节蛋白cyclinD1、CDK4和pRb表达下调。(6)下调piRNA-823的表达能抑制骨髓瘤细胞AKT及ERK磷酸化水平。(7)Antagomir-823可以显著抑制裸鼠皮下种植瘤的生长,有效降低裸鼠移植瘤内piRNA-823水平以及Bcl-2、cyclinDl和Ki-67的蛋白水平,升高caspase-3的蛋白水平。结论：piRNA-823在骨髓瘤细胞系上表达上调,沉默piRNA-823的表达能够抑制骨髓瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡以及阻滞细胞周期,伴随凋亡相关蛋白、周期调控蛋白和信号通路表达失常,最终在体内外抑制骨髓瘤细胞的生长。第三部分piRNA-823对骨髓瘤DNA甲基化的调节作用目的：初步探讨piRNA-823对骨髓瘤细胞DNA甲基化的调节作用。方法：设计合成piRNA-823特异性抑制物antagomir-823,利用脂质体将其转染至骨髓瘤RPMI8226或ARH-77细胞,下调piRNA-823的表达水平,实验设置正常对照组、阴性对照转染组及antagomir-823转染组三组。采用qRT-PCR及Western blotting方法分别检测各组骨髓瘤细胞上DNMT1、 DNMT3A及DNMT3B在mRNA水平和蛋白水平上的表达；采用qRT-PCF(?)法同时检测17例原代CD138+骨髓瘤细胞上piRNA-823, DNMT3A和DNMT3B的表达水平并进行相关性分析；通过DNA甲基化定量检测试剂盒检测各组骨髓瘤细胞全基因组DNA甲基化水平；通过Western blotting方法检测下调piRNA-823对RPMI8226细胞中p16蛋白表达水平的影响,通过免疫组织化学方法检测piRNA-823沉默对骨髓瘤裸鼠模型瘤体内p16蛋白表达水平的影响；采用MSP检测piRNA-823沉默对RPMI8226细胞中p16基因启动子区甲基化状态的影响。结果：(1)下调piRNA-823的表达能够在mRNA和蛋白水平抑制骨髓瘤细胞上DNMT3A和DNMT3B的表达,对DNMT1表达没有显著影响。(2)在17例原代CD138+骨髓瘤细胞上,piRNA-823与DNMT3A/DNMT3B的表达水平均明显呈正相关。(3)抑制piRNA-823的表达能够降低骨髓瘤细胞全基因组DNA甲基化水平,其作用效果与甲基化转移酶抑制剂地西他滨的作用效果相当。(4)下调RPMI8226细胞piRNA-823的表达能够分别在体内外上调骨髓瘤细胞及骨髓瘤裸鼠皮下成瘤组织内p16蛋白的表达水平。(5)MSP结果显示,下调)iRNA-823的表达可导致RPMI8226细胞上p16基因启动子区甲基化水平降低,由完全甲基化变为不完全甲基化。结论：piRNA-823通过DNMT3A和DNMT3B调节骨髓瘤细胞DNA甲基化水平,下调piRNA-823的表达能在mRNA和蛋白水平上抑制DNMT3A和DNMT3B表达,从而下调全基因组DNA甲基化水平,并降低p16基因启动子区甲基化水平,使p16蛋白恢复表达。第四部分piRNA-823对多发性骨髓瘤血管新生的影响目的：初步探讨piRNA-823对多发性骨髓瘤血管新生的影响。方法：设计合成piRNA-823特异性抑制物antagomir-823,利用脂质体将其转染至骨髓瘤RPMI8226及ARH-77细胞,下调piRNA-823的表达水平,实验设置正常对照组、阴性对照转染组及antagomir-823转染组三组。采用ELISA检测各组骨髓瘤细胞培养上清中、EGF分泌水平；利用0.4μm Transwell小室建立骨髓瘤细胞与脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养体系,Western blot法检测与各组RPMI8226细胞共培养的FUVECs内ERK及AKT的磷酸化水平；采用8μm Transwell小室迁移实验及小管形成实验,在体外研究各组骨髓瘤细胞培养上清对HUVECs血管新生能力的影响；用抗小鼠CD34及CD31抗体对骨髓瘤裸鼠皮下成瘤组织切片进行免疫组织化学法染色,通过体内实验研究下调piRNA-823表达的骨髓瘤细胞对肿瘤微血管密度的影响。结果：(1) piRNA-823表达下调的骨髓瘤细胞VEGF分泌水平明显下降。(2)骨髓瘤细胞上调与其共培养的]HUVECs上磷酸化AKT和ERK的表达水平,而piRNA-823下调的骨髓瘤细胞降低HUVECs上磷酸化AKT和ERK的表达水平。(3)体外实验结果显示piRNA-823下调的骨髓瘤细胞的培养上清可以抑制]HUVECs迁移能力及小管形成能力；体内实验结果显示抑制piRNA-823的表达能下调骨髓瘤裸鼠皮下成瘤组织中的微血管密度。结论：下调骨髓瘤细胞piRNA-823的表达可以抑制其VEGF分泌,进而在体内外抑制骨髓瘤细胞所诱导的血管新生作用。