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结直肠癌是目前全球最常见的消化道恶性肿瘤之一,在所有肿瘤中发病率位居前三。患者最终不良结局的主要原因是肿瘤的远处转移,因此转移的干预和治疗是改善预后的主要方法。通过结直肠癌转移机制的研究,寻找有效的分子标志物或者治疗靶点,为晚期结直肠癌提供新的治疗方法。甲基Cp G结合蛋白2（Methyl Cp G binding protein 2,MeCP2）是DNA甲基化结合蛋白,作为关键元件参与DNA甲基化修饰的调控。尽管MeCP2在神经系统疾病的研究中已比较多,但在肿瘤领域中的研究甚少。近年来已有研究报告MeCP2作为促癌基因在多种肿瘤中发挥作用,但其具体的生物学机制还没有定论。RNA甲基化（RNA methylation）中最常见的就是m~6A（N6-methyladenosine,6-甲基腺嘌呤）甲基化。m~6A甲基化动态修饰过程依靠甲基转移酶（METTL3、METTL14和WTAP）和去甲基化酶（ALKBH5和FTO）来实现。甲基转移酶样蛋白14（Methyltransferase-like protein 14,METTL14）是近年来发现的RNA甲基转移酶之一。目前人们对METTL14是具有促癌作用还是抑癌作用还是存在争议的。在本研究中,我们首先发现MeCP2能够增加结直肠癌细胞的转移能力。MeCP2作为DNA甲基化结合蛋白,似乎跟m~6A甲基化修饰没有明确的关联,然而我们证实了MeCP2表达的变化会影响结直肠癌细胞内整体的m~6A甲基化水平。MeCP2可以和甲基转移酶成员之一的METTL14发生蛋白质相互作用,并通过METTL14来影响m~6A甲基化水平。我们进一步证明了MeCP2通过METTL14调控靶基因Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4,KLF4）的m~6A甲基化,最终促进结直肠癌转移的生物学机制。本课题以结直肠癌为模型,围绕以下几点展开:MeCP2和METTL14在结直肠癌转移中的生物学意义;MeCP2通过和METTL14的蛋白质相互作用影响细胞内m~6A甲基化的生物学机制;确认MeCP2和METTL14能够通过m~6A甲基化位点共同调控靶基因KLF4;m~6A甲基化调控靶基因KLF4表达的生物学机制。1.MeCP2和METTL14在结直肠癌转移中的生物学意义结直肠癌临床样本检测表明,MeCP2在肿瘤组织中表达上调,高表达MeCP2的患者生存预后差。在体外实验中,构建稳定敲降和稳定过表达MeCP2的结直肠癌细胞系并进行细胞功能学实验,证实MeCP2可以促进结直肠癌细胞的转移。构建稳定敲降METTL14的结直肠癌细胞系并进行细胞功能学实验,证实METTL14可以抑制结直肠癌细胞的转移。在体内实验中,小鼠脾脏肝转移模型显示,MeCP2过表达和METTL14敲降都可导致结直肠癌细胞转移能力增强。2.MeCP2通过和METTL14的蛋白质相互作用影响细胞内m~6A甲基化的生物学机制通过两种检测方法共同证实MeCP2表达的变化影响结直肠癌细胞内整体的m~6A甲基化水平。通过多个免疫共沉淀实验,确认了MeCP2可以和甲基转移酶成员之一的METTL14发生蛋白质相互作用,MeCP2可以通过影响METTL14和METTL3的稳定二聚体来影响m~6A甲基化水平。3.确认MeCP2和METTL14能够通过m~6A甲基化位点共同调控靶基因KLF4基于以上的实验结果,我们合理的猜测MeCP2和METTL14对于结直肠癌细胞转移能力的调控是基于一个共同由m~6A甲基化调控的下游靶基因,且该靶基因可以直接调控结直肠癌细胞的转移能力。首先,将敲降METTL14和敲降MeCP2的结直肠癌细胞进行RNA-seq,筛选出共同受METTL14和MeCP2调控的下游候选靶基因;其次,根据网上公开的m~6A甲基化测序数据库,将候选靶基因中可能含有m~6A甲基化位点的片段序列筛选出并设计对应引物;最后,确认所有可能的m~6A甲基化修饰位点,并最终筛选出一段能够被MeCP2和METTL14共同调控的具有m~6A甲基化修饰位点的片段,这个具有m~6A甲基化修饰的片段是位于KLF4的蛋白质编码区（CDS区）末端,也符合多数的m~6A甲基化修饰所处位置。通过m RNA水平、蛋白质水平和m~6A甲基化水平的共同验证,多方面确认了KLF4是由MeCP2和METTL14共同调控的下游靶基因。构建稳定敲降和稳定过表达KLF4的结直肠癌细胞系并进行细胞功能学实验,确认KLF4可以抑制结直肠癌细胞的转移。4.m~6A甲基化调控靶基因KLF4表达的生物学机制在不同处理的稳转细胞中加入放线菌素D（Act D）来阻断新生m RNA的合成,在合适的时间点检测KLF4的m RNA水平,以观察KLF4的m RNA的降解速度。实验数据表明敲降METTL14和过表达MeCP2的结直肠癌细胞中KLF4的m RNA稳定性下降,而敲降MeCP2的结直肠癌细胞中KLF4的m RNA稳定性提高。将KLF4序列插入到荧光素酶表达基因载体中构建对照组（野生组）质粒,将预测到的两个可被m~6A甲基化修饰的腺嘌呤（A）突变为胞嘧啶（C）构建实验组（突变组）质粒,将两组质粒在293T细胞中分别表达,然后对荧光素强度进行检测。根据实验结果,确认KLF4上特异性m~6A甲基化位点是被MeCP2和METTL14共同调控的,同时该m~6A甲基化位点的存在能够提高KLF4的m RNA的稳定性。已有研究报道,RNA结合蛋白IGF2BPs家族能够识别m~6A甲基化修饰位点,并增加m RNA稳定性。通过实验观察到IGF2BP2能够特异性识别两个特殊的m~6A甲基化结合位点,这两个位点也即是上述预测到的m~6A甲基化修饰位点。以上结果说明,m~6A甲基化识别蛋白IGF2BP2能够识别KLF4上两个特殊的m~6A甲基化修饰位点,增加KLF4的m RNA的稳定性,并最终提高KLF4的m RNA和蛋白质水平。综合以上的研究结果,得出以下结论:（1）MeCP2在结直肠癌细胞中表达上调且能够促进结直肠癌细胞转移,高表达MeCP2提示患者不良预后;METTL14在结直肠癌细胞中表达下调且能够抑制结直肠癌细胞转移,低表达METTL14提示患者不良预后;（2）MeCP2和METTL14存在蛋白质相互作用,并通过该蛋白质相互作用最终影响结直肠癌细胞内m~6A甲基化水平;（3）MeCP2和METTL14能够共同调控KLF4上特异性的两个m~6A甲基化修饰位点;（4）m~6A甲基化识别蛋白IGF2BP2能够特异性识别KLF4的m RNA上的两个m~6A甲基化修饰位点,改变KLF4的m RNA的稳定性以及KLF4的m RNA和蛋白质水平,最终调控结直肠癌细胞的转移能力。